【生物】2019届一轮复习人教版基因工程教案 23页

第10章　现代生物科技专题 第43讲　基因工程 考纲要求 考情分析 命题趋势 ‎1．基因工程的诞生(Ⅰ)‎ ‎2．基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)‎ ‎3．基因工程的应用(Ⅱ)‎ ‎4．蛋白质工程(Ⅰ)‎ ‎2017，江苏卷，33T　　　　　　2017，全国卷Ⅰ，38T ‎2016，全国卷Ⅰ，40T 2016，天津卷，7T ‎2016，江苏卷，33T 2015，全国卷Ⅰ，40T ‎2015，全国卷Ⅱ，40T 2015，北京卷，5T 本讲是现代生物科技专题的重点，考查频率较高，预计明年的全国卷中，以非选择题的形式考查基因工程的原理、操作技术及应用的可能性较大 分值：6～16分 考点一　基因工程的操作工具及程序 一、基因工程的基本工具 ‎1．限制性核酸内切酶 ‎(1)来源：主要从__原核生物__中分离。‎ ‎(2)作用：切断两个核苷酸之间的__磷酸二酯键__。‎ ‎(3)作用特点：专一性，即限制酶可识别__特定的脱氧核苷酸序列__，切割特定位点。‎ ‎(4)结果 ‎2．DNA连接酶 常用类型 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 ‎__大肠杆菌__‎ T4噬菌体 功能 连接黏性末端 连接__黏性末端或平末端__‎ 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 ‎3．载体 ‎(1)常用载体——质粒 ‎(2)其他载体：λ噬菌体衍生物、__动植物病毒__等。‎ 二、基因工程的基本操作程序 ‎1．目的基因的获取 ‎(1)目的基因：编码蛋白质的基因。‎ ‎(2)获取方法：从基因文库中获取、利用__PCR技术__扩增目的基因、利用__DNA合成仪__人工合成。‎ ‎2．基因表达载体的构建——基因工程的核心 ‎(1)目的：使目的基因在受体细胞中__稳定存在__，并可以遗传给下一代；使目的基因能够__表达__和发挥作用。‎ ‎(2)基因表达载体的组成：目的基因、__启动子__、终止子和标记基因等，如图。‎ ‎3．将目的基因导入受体细胞 ‎4．目的基因的检测和鉴定 ‎(1)检测：‎ ‎(2)鉴定：个体水平。‎ ‎1．判断正误，正确的画“√”，错误的画“×”。‎ ‎(1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。(　×　)‎ ‎(2)DNA连接酶可把目的基因与载体的黏性末端的碱基黏合，形成重组DNA。(　×　)‎ ‎(3)E·coli DNA连接酶既可以连接平末端，又可以连接黏性末端。(　×　)‎ ‎(4)Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。(　×　)‎ ‎(5)基因表达载体中含有启动子和终止密码子。(　×　)‎ ‎(6)如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同。(　×　)‎ ‎(7)目的基因导入马铃薯细胞后，可随着马铃薯DNA分子的复制而复制，传给子代细胞并表达。(　×　)‎ ‎(8)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否表达。‎ ‎(　×　)‎ ‎2．若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau‎3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是(　D　)‎ A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 C．用BglⅡ和Sau‎3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 D．用EcoRⅠ和Sau‎3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 解析　解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcoRⅠ和Sau‎3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移动方向才一定与图丙相同。‎ ‎3．下列关于载体的叙述中，错误的是(　D　)‎ A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子 B．对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点 C．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒 D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割 解析　载体带有特殊的标记基因，如抗生素抗性基因，以便于对外源基因是否导入进行检测。‎ 确定限制酶的种类 ‎(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ‎①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。‎ ‎②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。‎ ‎③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。‎ ‎(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 ‎①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。‎ ‎②质粒作为载体必须具备标记基因等结构，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma Ⅰ 会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。‎ ‎ 一　基因工程的概念与操作工具分析 ‎1．限制酶 ‎(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如　，以中心线为轴，以为轴，两侧碱基互补对称。‎ ‎(2)切割后末端的种类 ‎2．限制酶和DNA连接酶的关系 ‎(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。‎ ‎(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。‎ ‎(3)限制酶是一类酶，而不是一种酶。‎ ‎(4)DNA连接酶起作用时，不需要模板。‎ ‎3．载体具备的条件 条件 适应性 稳定并能复制 目的基因稳定存在且数量可扩大 有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因 具有特殊的标记基因 便于重组DNA的鉴定和选择 ‎[例1] 如图是基因工程中利用pBR322质粒(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr 表示四环素抗性基因)与抗病基因构建重组质粒的示意图，该质粒上的PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四种限制酶的识别序列及切割位点见表。结合图表分析，下列叙述错误的是(　C　)‎ 限制酶 ApaⅠ EcoRⅠ PstⅠ SmaⅠ 识别序 列和切 割位点 ‎↓‎ AGCT TCGA ‎↑‎ ‎↓　　　 ‎ GAATTC CTTAAG ‎　　　↑‎ ‎　 ↓‎ GTGCAG CACGTC ‎ ↑　　　‎ ‎↓‎ CCCGGG GGGCCC ‎ ↑‎ A．pBR322质粒、抗病基因和重组质粒的基本组成单位都是脱氧核苷酸 B．形成重组质粒时，应选用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ对含抗病基因的DNA、质粒进行切割 C．一个质粒被限制酶EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ同时切割后可得到3个DNA片段和6个黏性末端 D．将受体细胞置于含有四环素的培养基上培养，可筛选出已导入抗病基因的受体细胞 解析　图中pBR322质粒、抗病基因和重组质粒都是DNA分子，其基本组成单位都是脱氧核苷酸；通过分析含抗病基因的DNA可知，该DNA含三个限制酶切割位点，其中SmaⅠ的切割位点位于抗病基因内部，因此用PstⅠ、EcoRⅠ才能完整地切下该抗病基因；一个质粒被限制酶EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ同时切割后可得到3个DNA片段，产生6个末端，从表格信息可知，EcoRⅠ、PstⅠ切割产生的4个末端是黏性末端，而SmaⅠ切割产生的2个末端是平末端；当EcoRⅠ切割质粒时，氨苄青霉素抗性基因(Ampr)已受到破坏，因此，在筛选时，应将受体细胞置于含有四环素的培养基上培养。‎ 与DNA有关的4种酶 比较 项目 限制酶 DNA 连接酶 DNA 聚合酶 解旋酶 作用 底物 DNA分子 DNA分 子片段 脱氧核 苷酸 DNA分子 作用 磷酸 磷酸 磷酸 碱基对间 部位 二酯键 二酯键 二酯键 的氢键 形成 产物 黏性末端 或平末端 形成重组 DNA分子 新的 DNA分子 形成单 链DNA ‎ 二　基因工程的基本操作程序 ‎1．获取目的基因 ‎(1) ‎(2)人工化学合成：适用于分子较小的基因。‎ ‎2．基因表达载体的构建——基因工程的核心 ‎(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。‎ ‎(2)基因表达载体组成 ‎(3)构建过程 ‎3．将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法 受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 ‎4．目的基因的检测与鉴定 ‎[例2] 在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因afp对提高农作物的抗寒能力有较好的应用价值。下图所示是获得转基因莴苣的技术流程，请据图回答下列问题：‎ ‎(1)获取目的基因的主要途径包括从自然界已有的物种中分离和__人工合成__。‎ ‎(2)①过程需要的酶有__限制(性核酸内切)酶__、__DNA连接酶__。‎ ‎(3)重组质粒除了带有抗冻蛋白基因afp以外，还必须含有启动子、终止子和__标记基因__，这样才能构成一个完整的基因表达载体。‎ ‎(4)如果受体细胞C1是土壤农杆菌，则将目的基因导入它的目的是利用农杆菌的__转化作用__，使目的基因进入受体细胞C2，并将其插入到受体细胞C2中的__染色体__上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，形成转基因莴苣。经②过程获得的转基因莴苣中的目的基因是否表达，在分子水平上可用__抗原—抗体杂交__法进行检测，如果出现杂交带，说明目的基因已经表达蛋白质产品，转基因莴苣培育成功。‎ 解析　(1)获取目的基因的主要途径有从自然界已有的物种中分离和人工合成。(2)①过程为基因表达载体的构建过程，需要用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶。(3)一个完整的基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。(4)农杆菌转化法利用的是农杆菌的转化作用，将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上，进而使目的基因能够稳定遗传和表达。检测目的基因是否成功表达可采用抗原—抗体杂交法。‎ ‎[例1] (2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。‎ 被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：‎ ‎(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有①______________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。‎ ‎(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是②________________________________；并且③__________________和④______________________________的细胞也是不能区分的，其原因是⑤__________________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有⑥__________的固体培养基。‎ ‎(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于⑦__________。‎ ‎[答题送检]来自阅卷名师报告 错误 致错原因 扣分 ‎(1)‎ 考生知识识记不全或语言表达不清 ‎－2‎ ‎(2)‎ ‎③④⑤空考生忽略了题中的关键词“含有氨苄青霉素”‎ ‎－7‎ 考生没有理解培养基对质粒的筛选原理 ‎－2‎ ‎(3)‎ 考生出现知识迁移障碍 ‎－2‎ ‎[解析] (1)质粒作为载体应具备的基本条件有：能自我复制、具有标记基因、含有一至多个限制酶切割位点等。(2)由题意可知，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞中均不含有氨苄青霉素抗性基因，所以在含有氨苄青霉素的培养基上均不能生长。质粒载体上含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，插入了目的基因的重组质粒中仅含有氨苄青霉素抗性基因，所以含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞均能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，但前者可以在含有四环素的培养基上生长而后者不能，所以可用含有四环素的培养基筛选出含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落。(3)噬菌体属于病毒，增殖过程中所需的原料、酶等均来自于受体细胞。‎ ‎[规范答题] (除注明外，每空2分)(1)能自我复制、具有标记基因 ‎(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长(3分)　四环素 ‎(3)受体细胞 ‎1．绞股蓝细胞中含有抗烟草花叶病毒(TMV)基因，可以合成一种抗TMV蛋白，叶片对TMV具有抗感染性。烟草是重要的经济作物，由于TMV的感染会导致大幅度减产。研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV的烟草，主要流程如图所示。‎ ‎(1)科学家首先从绞股蓝细胞中提取抗TMV基因转录的RNA，然后合成目的基因。图中过程①表示__逆转录__，获得的DNA必须在两侧添加__启动子__和__终止子__。‎ ‎(2)过程③构建重组Ti质粒时，必须使用__限制酶__和__DNA连接酶__两种工具酶。‎ ‎(3)由图分析，在过程③构建的重组Ti质粒上应该含有卡那霉素抗性基因作为__标记基因__，重组Ti质粒导入烟草体细胞的方法是__农杆菌转化法__。‎ ‎(4)在过程⑤培养基中，除含有卡那霉素及植物必需的各种营养成分外，还必须添加__植物激素(或生长素和细胞分裂素)__，以保证受体细胞能培养成再生植株。‎ ‎(5)过程⑥可采取__抗原—抗体杂交__的方法，检测植株是否合成了抗TMV蛋白。在个体水平的鉴定过程中，可通过__接种烟草花叶病毒__的方法来确定植株是否具有抗性。‎ ‎ 考点二　基因工程的应用成果和蛋白质工程 一、基因工程的应用 ‎1．植物基因工程：主要用于提高农作物的__抗逆能力__，以及改良__农作物的品质__和利用植物__生产药物__等方面。‎ ‎2．动物基因工程：主要应用于动物品种改良、建立__生物反应器__、__器官移植__等方面。‎ ‎3．基因工程药物：来源于转基因的__工程菌__。‎ ‎4．基因治疗：把__正常基因__导入病人体内，使该基因的__表达产物__发挥功能。‎ 二、蛋白质工程 ‎1．崛起缘由：天然蛋白质__不一定完全符合__人类生产和生活的需要。‎ ‎2．目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对__蛋白质的结构__进行分子设计。‎ ‎3．操作手段：基因修饰或基因合成。‎ ‎4．设计流程：预期蛋白质功能→设计预期蛋白质结构→推测应有的__氨基酸__序列→找到对应的__脱氧核苷酸__序列(基因)。‎ 三、PCR技术 ‎1．条件 DNA母链：PCR模板 ‎2．过程 ‎　‎ ‎1．判断正误，正确的画“√”，错误的画“×”。‎ ‎(1)我国的转基因抗虫棉转入的抗虫基因是Bt毒蛋白基因。(　√　)‎ ‎(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。(　×　)‎ ‎(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。(　×　)‎ ‎(4)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。(　×　)‎ ‎(5)基因工程药物主要来源于转基因动物生产。(　×　)‎ ‎(6)基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。(　√　)‎ ‎(7)蛋白质工程可按照人类意愿生产出自然界中不存在的蛋白质。(　√　)‎ ‎(8)人类主要通过直接改造蛋白质的结构来生产新的蛋白质。(　×　)‎ ‎2．在基因工程技术中，需要用氯化钙处理的步骤是(　C　)‎ A．目的基因的提取 B．目的基因与载体结合 C．将目的基因导入受体细胞 D．目的基因的检测与表达 ‎3．蛋白质工程与基因工程相比，其突出特点是(　B　)‎ A．基因工程原则上能生产任何蛋白质 B．蛋白质工程能对现有的蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质 C．蛋白质工程可以不通过转录和翻译来实现 D．蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第三代基因工程 解析　基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，A项错误；蛋白质工程通过对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，B项正确；蛋白质是通过转录和翻译形成的，蛋白质工程必须通过转录和翻译来实现，C项错误；蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，D项错误。‎ ‎ 一　基因工程的应用及蛋白质工程 ‎1．乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较 ‎(1)概念 ‎①乳腺生物反应器是指导入外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。‎ ‎②工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。‎ ‎(2)两者的区别 比较项目 乳腺生物反应器 工程菌 基因结构 动物基因的结构与人类基因的结构基本相同 细菌或酵母菌等生物基因的结构与人类基因的结构有较大差异 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，产生的药物蛋白可能没有活性 受体细胞 动物的受精卵 微生物细胞 导入目的基因的方式 显微注射法 感受态细胞法 生产条件 不需严格灭菌，温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞中提取 生产设备 畜牧业生产，加提取设备 工业生产，设备精良 ‎2．基因治疗与基因诊断 原理 操作过程 进展 基因表达 基因治疗 利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗 临床实验 基因诊断 碱基互补配对 制作特定DNA探针与病人样品DNA混合分析杂交带情况 临床应用 ‎3．蛋白质工程与基因工程 项目 蛋白质工程 基因工程 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质 有关基因工程应用的4个易错点 ‎(1)动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。‎ ‎(2)Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。‎ ‎(3)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。‎ ‎(4)并非所有个体都可作为乳腺生物反应器。操作成功的应该是雌性个体，个体本身的繁殖速度较快，泌乳量、蛋白含量等都是应该考虑的因素。‎ ‎[例1] 科学家对鼠源杂交瘤抗体进行改造，生产出效果更好的鼠—人嵌合抗体，用于癌症治疗。如图表示鼠—人嵌合抗体的形成过程，据图回答：‎ ‎(1)改造鼠源杂交瘤抗体，生产鼠—人嵌合抗体，属于__蛋白质工程__(填生物工程)的范畴。‎ ‎(2)图示过程是根据预期的__嵌合抗体功能__，设计__嵌合抗体的结构__，最终必须对__基因__进行操作，此操作中改变的是__碱基对__。‎ ‎(3)经过改造的鼠—人嵌合抗体，与鼠源杂交瘤抗体相比较，突出的优点是__对人体的不良反应减小__(从免疫角度考虑)。‎ ‎(4)上述过程中对科学家来说难度最大的是__设计嵌合抗体的空间结构__。‎ 解析　(1)通过图示可知，鼠—人嵌合抗体是通过人工设计而形成的特定功能的蛋白质，其生产过程应属于蛋白质工程的范畴。(2)蛋白质工程的流程：预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)。(3)从免疫的角度考虑，对人体来说鼠源抗体为抗原，若利用人的抗体与之嵌合，则排斥作用会减轻，对人体的负作用会减小。(4)由于蛋白质空间结构比较复杂，不易确定，所以成为蛋白质工程中最大的障碍。‎ ‎ 二　PCR技术的基本操作和应用 ‎1．PCR反应的原理——DNA双链复制 ‎2．PCR反应的过程 ‎(1)变性：当温度上升到‎90 ℃‎以上时，双链DNA解聚为单链，如下图：‎ ‎(2)复性：温度下降到‎50 ℃‎左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：‎ ‎(3)延伸：温度上升到‎72 ℃‎左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如图：‎ ‎(4)PCR技术的注意事项：PCR是通过控制温度实现的，需要在PCR仪中进行，PCR扩增的DNA片段是由两种引物决定的。‎ 细胞内DNA复制与PCR技术的比较 细胞内DNA复制 PCR 不 同 点 解旋 在解旋酶作用下，边解旋边复制 ‎90 ℃‎以上高温解旋，双链完全分开 酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 引物 RNA DNA或RNA 温度 体内温和条件 高温 相 同 点 ‎①需提供DNA复制的模板；‎ ‎②四种脱氧核苷酸为原料；‎ ‎③子链延伸的方向都是从5′端到3′端 ‎[例2] (2017·江苏卷)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：‎ ‎ (1)从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过__逆转录__获得__cDNA__用于PCR扩增。‎ ‎(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的__限制性核酸内切酶__位点。设计引物时需要避免引物之间形成__碱基互补配对__，而造成引物自连。‎ ‎(3)图中步骤1代表__变性__，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。‎ ‎(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏__引物与模板__的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但__GC含量高__的引物需要设定更高的退火温度。‎ ‎(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有__②③__(填序号：①升高退火温度　②降低退火温度 ‎③重新设计引物)。‎ 解析　(1)PCR技术可在体外对DNA进行扩增，模板可以是mRNA经过逆转录获得的cDNA。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)时，需在引物中增加适当的限制性核酸内切酶的识别序列，便于目的基因与质粒的连接。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火(复性)，步骤3为延伸，这三个步骤构成一个循环。(4)退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，过高的退火温度会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间的氢键数多于A、T之间的氢键数，故GC含量高的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果 PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高使扩增效率降低，也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，因此可以采取的措施是降低退火温度、重新设计引物等。‎ ‎[例1] (2015·全国卷Ⅰ)HIV属于逆转录病毒，是艾滋病的病原体。回答下列问题：‎ ‎(1)用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时，可先提取HIV中的__________，以其作为模板，在__________的作用下合成__________，获取该目的蛋白的基因，构建重组表达载体，随后导入受体细胞。‎ ‎(2)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是__________，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是__________________________。‎ ‎(3)已知某种菌导致的肺炎在健康人群中罕见，但是在艾滋病患者中却多发。引起这种现象的根本原因是HIV主要感染和破坏了患者的部分__________细胞，降低了患者免疫系统的防卫功能。‎ ‎(4)人的免疫系统有__________癌细胞的功能。艾滋病患者由于免疫功能缺陷，易发生恶性肿瘤。‎ ‎[答题送检]来自阅卷名师报告 错误 致错原因 扣分 ‎(1)‎ 没记住HIV是RNA病毒致错 ‎－6‎ ‎(2)‎ 未理解检测原理就是抗体与抗原的特异性结合 ‎－2‎ ‎(3)‎ 考生对HIV的特定攻击对象记忆不清 ‎－2‎ ‎(4)‎ 免疫系统的监控和清除功能容易被忽略 ‎－3‎ ‎[解析] (1)HIV为逆转录病毒，其遗传物质为RNA，提取其体内的RNA，在逆转录酶的催化作用下，经逆转录过程合成DNA，获取目的基因，构建基因表达载体，随后导入受体细胞。(2)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，将其作为抗原注入机体后，机体会产生特异性抗体，根据抗原抗体特异性结合的原理，利用抗原—抗体杂交技术，可用于检测受试者血清中的HIV。(3)HIV的靶细胞是人体中的T细胞，侵染之后，导致部分T细胞被破坏，降低了患者免疫系统的防卫功能。(4)人体的免疫系统有三大功能，即防卫、监控、清除。艾滋病患者易发生恶性肿瘤的原因是其免疫系统监控、清除癌细胞的功能缺陷。‎ ‎[规范答题] (除注明外，每空2分)(1)RNA　逆转录酶　cDNA(或DNA)‎ ‎(2)抗体　抗原抗体特异性结合 ‎(3)T(或T淋巴)‎ ‎(4)监控和清除(3分)‎ ‎1．(2015·全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸。改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：‎ ‎(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的__氨基酸序列(或结构)__进行改造。‎ ‎(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰__P__基因或合成__P1__基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括__DNA和RNA(或遗传物质)__的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：__DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)__。‎ ‎(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过__设计蛋白质的结构__和__推测氨基酸序列__，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物__功能__进行鉴定。‎ ‎1．(2017·全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：‎ ‎(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是__基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A__。‎ ‎(2)若用家蚕作为表达基因A的载体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用__噬菌体__作为载体，其原因是__噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕__。‎ ‎(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有__繁殖快、容易培养__(答出两点即可)等优点。‎ ‎(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是__蛋白A的抗体__(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。‎ ‎(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是 ‎__DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体__。‎ 解析　(1)人为真核生物，从人的基因组文库中获取的基因A含有内含子，基因A转录出的产物中有与内含子对应的RNA序列。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，因此以大肠杆菌作为受体细胞，不能切除内含子对应的 RNA序列，无法表达出蛋白A。(2)噬菌体和动物病毒均可作为基因工程的载体，但它们的宿主细胞不同。题中受体为家蚕，是一种昆虫，因此应选择昆虫病毒作为载体，噬菌体的宿主是细菌，不适合作为该实验的载体。(3)大肠杆菌具有繁殖快、容易培养、单细胞、遗传物质少等优点，因此，常作为基因工程的受体细胞。(4)常用抗原—抗体杂交的方法检测目的基因是否表达，故能用于检测蛋白A的物质为蛋白A的抗体。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型菌的DNA转移到了R型菌体内，其对基因工程理论的建立提供的启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。‎ ‎2．(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau‎3AⅠ三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau‎3AⅠ的切点是唯一的)。‎ 根据基因工程的有关知识，回答下列问题：‎ ‎(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被__Sau‎3AⅠ__酶切后的产物连接，理由是__两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端__。‎ ‎(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有__甲和丙__，不能表达的原因是__甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录__。‎ ‎(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有__E·coli_DNA连接酶__和__T4_DNA连接酶__，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是__T4_DNA连接酶__。‎ 解析　(1)分析图(a)可知，限制酶Sau‎3AⅠ与BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。(2)‎ 构建基因表达载体时，为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达，目的基因应插入在启动子和终止子之间，据此可判断甲、丙均不符合要求，目的基因均不能被转录。(3)常见的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和 T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。‎ ‎3．(2016·天津卷)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。‎ ‎(1)为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取__总RNA(或mRNA)__合成总cDNA，然后以cDNA为模板，使用PCR技术扩增HSA基因。图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。‎ ‎(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是__B__(单选)。‎ A．人血细胞启动子　　　　　　 B．水稻胚乳细胞启动子 C．大肠杆菌启动子 D．农杆菌启动子 ‎(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是__吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化__。‎ ‎(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是__水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工__。‎ ‎(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与__HSA__的生物学功能一致。‎ 解析　(1)总cDNA是以mRNA为模板逆转录合成的，所以需要提取人的总RNA或mRNA；PCR扩增的原理是DNA复制，DNA复制时，两条子链的延伸方向相反，所以引物的位置及方向如图所示。(2)要使rHSA基因在水稻胚乳细胞内特异性表达，需要选择水稻胚乳细胞的启动子。(3)酚类物质可吸引农杆菌移向水稻受体细胞，使农杆菌Ti质粒上的T－DNA转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上，有利于目的基因成功转化。(4)大肠杆菌为原核生物，无内质网和高尔基体，不能对多肽进行高效加工，而水稻是真核生物，具有内质网和高尔基体，可对多肽链进行高效加工。(5)要证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与HSA的生物学功能一致。‎ 答案　(1)如图所示 课时达标　第43讲 ‎1．‎ 基因打靶技术是建立在基因同源重组技术以及胚胎干细胞技术的基础上而发展起来的一种分子生物学技术。结合图示回答问题。‎ ‎(注：neor是新霉素抗性基因；tk基因的表达可以使无毒的丙氧鸟苷代谢为毒性物质，导致细胞死亡。)‎ ‎(1)将目的基因和与细胞内靶基因同源的DNA 片段都重组到__载体(或质粒)__上，构建打靶载体(基因表达载体)。‎ ‎(2)打靶载体测序验证正确后，利用__限制__酶将之线性化，以提高重组率。通过__显微注射__技术导入胚胎干细胞，这样打靶载体与细胞内靶基因同源的区段就有几率发生同源重组。‎ ‎(3)为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入__新霉素和丙氧鸟苷__。最后还需要通过__DNA分子杂交__技术鉴定同源重组的细胞(去除靶基因)，将这样的细胞通过__动物细胞(或克隆)__培养后，获得大量打靶成功的细胞。其中，暂时不用的细胞进行液氮或冷冻保存。‎ ‎(4)将打靶成功的细胞注射入小鼠囊胚，移植到同种、__生理状态相同(或经同期发情)__的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行妊娠检查，确保其生下嵌合小鼠。这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。如果某些小鼠的__生殖细胞__(填“体细胞”或“生殖细胞”)恰巧被“修饰”过了，则它们的杂交后代中，就可能出现基因完全被“修饰”过的小鼠。‎ 解析 (1)构建打靶载体(基因表达载体)，需要将目的基因和与细胞内靶基因同源的DNA片段都重组到载体(或质粒)上。(2)将环状的打靶载体线性化，需利用限制酶进行切割，通过显微注射技术将其导入胚胎干细胞。(3)在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，但新霉素抗性基因得以保留且结构完整，所以为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入新霉素和丙氧鸟苷。鉴定去除靶基因的同源重组细胞，可通过DNA分子杂交技术。将这样的细胞通过动物细胞培养后，获得大量打靶成功的细胞。(4)胚胎移植时，需将含有打靶成功细胞的囊胚移植到同种、生理状态相同(或经同期发情)的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行妊娠检查，确保其生下嵌合小鼠。生殖细胞参与新个体的形成过程，如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被“修饰”过了，则它们的杂交后代中，就可能出现基因完全被“修饰”过的小鼠。‎ ‎2．家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。‎ ‎(1)进行转基因操作前，需用__胰蛋白(或胶原蛋白)__酶短时处理幼蚕组织，‎ 以便获得单个细胞。‎ ‎(2)为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的__启动子__和__终止子__之间。‎ ‎(3)采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液(含Mg2＋)、水、4种脱氧核苷酸、模板DNA、__Taq酶(或热稳定性DNA聚合酶)__和__引物__。‎ ‎(4)利用生物反应器培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制。通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以__增大细胞贴壁生长的附着面积__，增加培养的细胞数量，也有利于空气交换。‎ 解析　(1)为了使组织分散为单个细胞通常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理。(2)基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因和标记基因。启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端。(3)PCR反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液(含Mg2＋)、水、4种脱氧核苷酸、模板DNA、Taq酶(热稳定的DNA聚合酶)和引物。(4)利用生物反应器培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制。通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以增大细胞贴壁生长的附着面积，增加培养的细胞数量，也有利于空气交换。‎ ‎3．苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。图1是转Bt毒素蛋白基因植物的重组DNA形成过程示意图，图2是毒素蛋白基因进入植物细胞后发生的两种生物大分子合成的过程，据图回答下列问题：‎ ‎(1)将图1 ①的DNA用HindⅢ、BamHⅠ完全酶切后，反应管中有__4__种DNA片段。过程②需要用到__DNA连接__酶。‎ ‎(2)假设图1中质粒原来的BamHⅠ识别位点的碱基序列变为了另一种限制酶BclⅠ识别位点的碱基序列，现用BclⅠ和HindⅢ切割质粒，则图1中①的右侧还能选择BamHⅠ进行切割来获得所需重组质粒吗？请说明理由__能。BamHⅠ酶和BclⅠ酶切割后形成的黏性末端相同__。‎ ‎(3)若上述假设成立，并成功形成重组质粒，则重组质粒(　D　)‎ A．既能被BamHⅠ切开也能被HindⅢ切开 B．能被BamHⅠ切开但不能被HindⅢ切开 C．既不能被BamHⅠ切开也不能被HindⅢ切开 D．能被HindⅢ切开但不能被BamHⅠ切开 ‎(4)图2中α链是__mRNA__。不同组织细胞的相同DNA进行过程③时启用的起始点__不完全相同__(填“都相同”“都不同”或“不完全相同”)。其原因是__不同组织细胞中基因会进行选择性表达__。‎ ‎(5)要想检测导入的Bt毒素蛋白基因是否表达，在分子水平上可用__抗原—抗体杂交__法进行检测，如果出现杂交带，说明目的基因已经表达蛋白质产品，转基因植物培育成功。‎ 解析　(1)由于上述两种酶形成的末端不一样，所以被两种不同的限制酶切割之后所形成的片段有4种。(2)BclⅠ与BamHⅠ酶切割后形成的黏性末端一样，故该图1中①的右侧还能选择BamHⅠ酶进行切割，并能获得所需重组质粒。(3)根据酶切位点和识别的碱基序列可知，重组质粒只能被HindⅢ切开但不能被BamHⅠ切开。(4)从图2可知，α链是以DNA的一条链作为模板进行转录形成的mRNA分子，不同组织细胞的相同DNA在转录时，如果是相同基因一般转录起点相同，不同的基因转录起点不同。(5)检测目的基因是否在受体细胞内表达的分子水平上的检测是向分泌物中加入抗体，利用抗原—抗体杂交法。‎ ‎4．如图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列问题。‎ ‎(1)若限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—↓GATC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，那么在①过程中，应用限制酶__Ⅱ__切割质粒，用限制酶__Ⅰ(或Ⅰ和Ⅱ)__切割抗虫基因。①过程在__体外__(填“体内”或“体外”)进行。‎ ‎(2)通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有__四环素__的培养基上，若大肠杆菌能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入。该培养基从功能方面属于__选择__培养基。‎ ‎(3)重组质粒导入大肠杆菌的目的是__大量复制目的基因(抗虫基因)__。‎ ‎(4)⑤过程所用技术称为__植物组织培养__，从遗传学角度来看，根本原因是根细胞具有__发育成完整个体的全部遗传物质__。‎ ‎5．许多大肠杆菌的质粒上含有lacZ基因，其编码的产物β半乳糖苷酶在Xgal和IPTG存在的条件下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。基因工程中常利用该原理从导入质粒的受体细胞中筛选出真正导入重组质粒的细胞，过程如图所示。请据图回答下列问题：‎ ‎(1)基因工程中，构建基因表达载体的目的是__使目的基因在受体细胞中稳定存在，能遗传给后代，并表达和发挥作用__。‎ ‎(2)限制酶EcoRⅠ的识别序列和切割位点是—G↓AATTC—，SmaⅠ的识别序列和切割位点是—CCC↓GGG—。图中目的基因被切割下来和质粒连接之前，需在目的基因的右侧连接相应的末端，连接的末端序列是__－TTAA__，连接过程中需要的基本工具是__DNA连接酶__。‎ ‎(3)转化过程中，大肠杆菌应先用__Ca2＋__处理，使其处于能吸收周围DNA的状态。‎ ‎(4)菌落颜色为白色的是__菌落③__，原因是__lacZ标记基因区插入外源基因后被破坏，不能表达出β半乳糖苷酶，故菌落为白色__。‎ ‎(5)菌落③中的目的基因是否表达，可采用的检测办法是__抗原—抗体杂交__。‎ 解析　(1)基因工程中，构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，能遗传给后代，并表达和发挥作用。(2)根据限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ的识别序列、切割位点和图解判断，图中目的基因被切割下来和质粒连接之前，需在目的基因的右侧连接相应的末端，连接的末端序列是－TTAA，连接过程中需要的基本工具是DNA连接酶。(3)转化过程中，大肠杆菌应先用Ca2＋处理，使其处于能吸收周围DNA的状态。(4)由于lacZ标记基因区插入外源基因后被破坏，不能表达出β半乳糖苷酶，故菌落③为白色菌落。(5)可采用抗原—抗体杂交的办法检测菌落③中的目的基因是否表达。‎ ‎6．在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因(kan)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。如图为获得抗虫棉的技术流程。请据图回答：‎ ‎(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、__基因表达载体的构建__、将目的基因导入受体细胞、__目的基因的检测与鉴定__。‎ ‎(2)A过程需要的酶有__限制酶__和__DNA连接酶__。‎ ‎(3)要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必须用__Ca2＋__处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为__感受__态；然后将__重组质粒和感受态细胞__在缓冲液中混合培养完成转化过程。‎ ‎(4)含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组织后，将离体棉花叶片组织培养成再生植株要经过[C]__脱分化__和[E]__再分化__。如要确保再生植株中含有抗虫基因，可在C过程的培养基中加入__卡那霉素__。‎ ‎(5)目的基因能否在棉花植株体内维持稳定和表达其遗传特性的关键是__目的基因是否插入受体细胞的DNA分子上__，这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是__DNA分子杂交技术__。‎