【生物】2020届 一轮复习 人教版 基因工程 学案 25页

‎2020届 一轮复习 人教版 基因工程 学案 考纲要求 ‎1.基因工程的诞生(Ⅰ)。2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)。‎ ‎3．基因工程的应用(Ⅱ)。4.蛋白质工程(Ⅰ)。5.DNA的粗提取与鉴定(实验与探究能力)。‎ 考点一　基因工程的操作工具 ‎1.　限制酶和DNA连接酶的关系 ‎ ‎(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。‎ ‎(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。‎ ‎(3)DNA连接酶起作用时，不需要模板。‎ ‎2.　DNA相关六种酶的比较 ‎ ‎1．目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图所示。‎ ‎(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于筛选(鉴别)目的基因是否导入受体细胞。‎ ‎(2)pBR322分子中有单个EcoR Ⅰ限制酶作用位点，EcoR Ⅰ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G和A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR Ⅰ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR Ⅰ切割后所形成的黏性末端。‎ 答案：如下所示：‎ ‎ ‎ ‎(3)pBR322分子中另有单个的BamH Ⅰ限制酶作用位点，现将经BamH Ⅰ处理后的质粒与用另一种限制酶Bgl Ⅱ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复磷酸二酯键，成功获得了重组质粒，说明两种限制酶(BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ)切割得到的黏性末端相同。‎ ‎(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。‎ 解析：(1)质粒作为基因表达载体的条件之一是要有抗性基因，以便于筛选(鉴别)目的基因是否导入受体细胞。‎ ‎(2)同一限制酶切割DNA分子产生的黏性末端相同，该目的基因两侧被限制酶EcoR Ⅰ切割后所形成的黏性末端为：‎ ‎(3)DNA连接酶催化两个DNA片段形成磷酸二酯键；而通过DNA连接酶作用能将两个DNA片段连接，表明经两种限制酶(BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ)切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。‎ ‎(4)由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶BamH Ⅰ作用后，标记基因tetR被破坏，故导入目的基因的大肠杆菌不能抗四环素，即多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。‎ ‎2．图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp Ⅰ、BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ、Sma Ⅰ 4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为 C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：‎ ‎(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖连接。‎ ‎(2)若用限制酶Sma Ⅰ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是平末端，其产物长度为537_bp、790_bp、661_bp。‎ ‎(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶Sma Ⅰ完全切割，产物中共有4种不同长度的DNA片段。‎ ‎(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是BamH Ⅰ。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加抗生素B的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接。‎ 解析：(1)一条脱氧核苷酸链中相邻的两个碱基之间是通过“—脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖—”相连的。(2)从Sma Ⅰ的识别序列和酶切位点可知，其切割后产生的是平末端，图1中DNA片段有两个Sma Ⅰ的识别序列，故切割后产生的产物长度为534＋3＝537(bp)、796－3－3＝790(bp)和658＋3＝661(bp)的三个片段。(3)图示方框内发生碱基对的替换后，形成的d基因失去了1个Sma Ⅰ的识别序列，故D基因、d基因用Sma Ⅰ完全切割所得产物中除原有D基因切割后的3种长度的DNA片段外，还增加一种d基因被切割后出现的长度为537＋790＝1 327(bp)的DNA片段。(4)目的基因的两端都有BamH Ⅰ的识别序列，质粒的启动子后抗生素A抗性基因上也有BamH Ⅰ的识别序列，故应选用的限制酶是BamH Ⅰ，此时将抗生素B抗性基因作为标记基因，故筛选时培养基中要添加抗生素B。经过同种限制酶切割后会产生相同的末端，部分目的基因与质粒反向连接而导致基因无法正常表达。‎ ‎1.　基因工程操作的易错点分析 ‎ ‎(1)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。‎ ‎(2)启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。‎ ‎(3)基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。‎ ‎(4)只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象，其余三步都有碱基互补配对现象。‎ ‎2.　DNA复制与PCR技术的比较 ‎ ‎3.　正确理解PCR技术 ‎ ‎(1)DNA单链有方向性，DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。‎ ‎(2)PCR过程中无解旋酶，破坏氢键需要升高温度，但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键，因此，热变性后产生的是DNA单链，并不是脱氧核苷酸。‎ ‎(3)复性只是引物与DNA单链的结合，并未形成子链DNA，子链DNA是在延伸阶段形成的。‎ ‎1．(2019·抚州模拟)在生物的生长发育过程中，基因是选择性表达的。要想获得某真核生物极为稀少的mRNA及其克隆，可以用如图所示的差异杂交法。Poly(A)是指位于mRNA上的150～200个腺苷酸残基。请回答下列问题。‎ ‎(1)利用表达目的mRNA的细胞获得放射性标志的探针时，需要用反转录酶，可以用Poly(A)作为引物。‎ ‎(2)用羟基磷灰石柱层析法，回收未杂交的32P标记的单链DNA(填“未杂交的32P标记的单链DNA”或“杂交分子”)，用于构建cDNA(填“基因组”或“cDNA”)文库。‎ ‎(3)在生物的生长发育过程中，由于基因选择性表达导致多细胞生物体中的细胞趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。在基因工程中可利用PCR技术使目的基因大量扩增。‎ ‎(4)若用NaOH水解除去mRNA获得的分子与不表达目的mRNA细胞中获得的单链DNA杂交，可能形成杂合双链区和游离的单链区，原因是 DNA分子中含有内含子、非编码区等序列，mRNA分子中没有互补的碱基序列，仍然为两条游离的单链，所以出现游离单链区。DNA分子中含有外显子序列，mRNA中具有互补的碱基序列，互补碱基序列结合在一起，形成杂合双链区。‎ 解析：(1)分析图解可知，利用表达目的mRNA的细胞获得放射性标志的探针的过程就是反转录过程，因此需要用反转录酶，可用Poly(A)作为引物。‎ ‎(2)根据题意可知“要想获得某真核生物极为稀少的mRNA及其克隆”，因此用羟基磷灰石柱层析法，回收未杂交的32P标记的单链DNA，由于该DNA是利用mRNA反转录而来，不包含这种生物的全部基因，因此构建的是cDNA文库。‎ ‎(3)在生物的生长发育过程中，由于基因选择性表达导致细胞分化，该过程使多细胞生物体中的细胞趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。在基因工程中可利用PCR技术使目的基因大量扩增。‎ ‎(4)DNA分子中含有内含子、非编码区等序列，mRNA分子中没有互补的碱基序列，仍然为两条游离的单链，所以出现游离单链区。DNA分子中含有外显子序列，mRNA中具有互补的碱基序列，互补碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区，因此用NaOH水解除去mRNA获得的分子与不表达目的mRNA细胞中获得的单链DNA杂交，可能形成杂合双链区和游离的单链区。‎ ‎2．苦荞是一种有名的经济植物，其含有的黄酮类化合物具有降血糖、血脂等功效。CHS是合成黄酮类化合物的关键酶。有人把经修饰的CHS基因导入苦荞细胞中，培育高产黄酮苦荞品系。按图示回答：‎ ‎(1)过程①中将修饰后的CHS基因与Ti质粒连接成重组Ti质粒的酶称为DNA连接酶。这种酶主要有两类，一类是从T4噬菌体中分离得到的，另一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E·coli_DNA连接酶。这两类酶都能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。‎ ‎(2)图中过程②操作前，需先用Ca2＋处理农杆菌，使其成为感受态细胞。‎ ‎(3)检测转基因苦荞培育是否成功，不能用抗原—抗体杂交技术进行检测的原因是转基因苦荞植株与普通苦荞植株都含有黄酮类化合物，可以比较转基因苦荞与普通苦荞的黄酮类化合物含量或测定细胞中CHS含量进行鉴定。‎ 解析：(1)连接重组质粒需要DNA连接酶，从大肠杆菌中分离出的DNA连接酶称为E·coli DNA连接酶，DNA连接酶作用的对象为磷酸二酯键。‎ ‎(2)Ca2＋处理农杆菌，增加膜的通透性，使其成为感受态细胞，利于外源DNA进入。‎ ‎(3)判断转基因苦荞培育是否成功，可以比较转基因苦荞与普通苦荞的黄酮类化合物的含量或细胞中CHS的含量。‎ ‎3．黑麦草中含有拮抗除草剂草甘膦的基因，该基因编码抗草甘膦酶，从而使草甘膦失去对植物的毒害作用。2015年8月，中国科学院和北京奥瑞金种业有限公司通过转基因技术获得了抗除草剂草甘膦的玉米新品种。培育新品种过程中用到了PCR技术(如图所示)，请回答下列问题：‎ ‎(1)应从cDNA文库(填“cDNA文库”或“基因组文库”)中选取拮抗除草剂草甘膦的基因，体外获得大量拮抗除草剂草甘膦基因要利用PCR技术，其中的物质A为引物。‎ ‎(2)基因工程操作的核心是基因表达载体的构建。‎ 若需要对转入拮抗除草剂草甘膦基因的玉米进行个体生物学水平的鉴定，需要对玉米做喷洒草甘膦实验。‎ ‎(3)若实验现象不理想，为提高抗草甘膦酶活性需利用蛋白质工程设计和改造抗除草剂草甘膦的基因。‎ 解析：(1)拮抗除草剂草甘膦基因属于真核生物的基因，需从cDNA文库中获得。体外获得大量拮抗除草剂草甘膦基因要利用PCR技术，该技术的原理为DNA双链复制，延伸过程中以DNA每条链为模板，需要引物的加入。‎ ‎(2)基因工程操作的核心是基因表达载体的构建。若需要对转入拮抗除草剂草甘膦基因的玉米进行个体生物学水平的鉴定，需要对玉米做喷洒草甘膦的实验。‎ ‎(3)若想提高抗草甘膦酶活性需用蛋白质工程设计和改造抗除草剂草甘膦基因。‎ 考点三　基因工程的应用及蛋白质工程 基因工程和蛋白质工程的比较 ‎ ‎1．利用动物乳腺生产产品的技术称为动物乳腺反应器技术。该技术生产的药用蛋白具有表达效率高、成本低、安全性高、易于分离纯化的优点，可产生乙肝表面抗原及抗凝血酶Ⅲ等医药产品，造福人类健康。下图为利用生物技术获得这一生物新品种和抗虫棉的过程，据图回答：‎ ‎(1)在基因工程中，A表示目的基因，如果直接从苏云金芽孢杆菌中获得抗虫基因，①过程使用的酶的功能特点是一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子，B表示基因表达载体(重组DNA分子)。‎ ‎(2)在研究过程中，研究人员首先从相关基因组中获取了目的基因，并采用PCR技术对目的基因进行了扩增，然后将目的基因与质粒等载体组合形成了重组载体。在重组载体的构建过程中需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶。‎ ‎(3)将目的基因导入受体细胞，在③过程中一般采用农杆菌转化法，在②过程中一般采用显微注射技术，受体细胞一般是受精卵。‎ ‎(4)由于转基因表达产物存在于山羊的乳汁中，检测其体内是否出现药用蛋白，在分子水平上的检测方法及结果是什么？从转基因羊的乳汁中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若出现杂交带，表明乳汁中出现了抗原蛋白，实验成功；若没有出现杂交带，表明乳汁中没有出现抗原蛋白，实验失败。‎ ‎(5)要确定目的基因(抗虫基因)导入棉花细胞后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，请写出在个体水平上的鉴定过程：让害虫食用转基因棉的叶子，观察害虫的存活情况，以确定其是否具有抗虫性状。‎ 解析：(1)据图可知，A是从人的DNA分子中获取的合成乙肝表面抗原或抗凝血酶Ⅲ 的基因，或者是从苏云金芽孢杆菌中提取的Bt毒蛋白基因，在基因工程中称为目的基因；基因工程的工具有限制酶、DNA连接酶、载体等，其中限制酶的功能特点是：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子；B是载体和目的基因重组形成的基因表达载体(重组DNA分子)。(2)目的基因的获取一般有3种途径：从基因文库中获取目的基因；利用PCR技术扩增目的基因；通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶。(3)目的基因导入受体细胞的方法因受体细胞的不同而不同，植物细胞通常采用农杆菌转化法，动物细胞通常采用显微注射法，微生物细胞通常采用Ca2＋处理法。其中动物通常的受体细胞是受精卵。(4)检测目的基因是否已经表达出相应的蛋白质，通常采用抗原—抗体杂交技术。(5)进行个体生物学水平的鉴定时，通常采用抗虫或抗病的接种实验。‎ ‎2．(2019·东北三校联考)马铃薯是重要的经济作物，在基因育种方面取得丰硕成果。‎ ‎(1)马铃薯是双子叶植物，常用农杆菌转化法将目的基因导入马铃薯受体细胞中。构建好的基因表达载体基本结构有：目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点五部分。‎ ‎(2)马铃薯易患多种疾病，导致产量下降。基因工程中常用的抗病基因为病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因、几丁质酶基因和抗毒素合成基因(写一种即可)。‎ ‎(3)科学家还培育出抗除草剂的转基因马铃薯，主要从两个方面进行设计：‎ ‎①修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感，或使靶蛋白过量表达，植物吸收除草剂后仍能正常代谢。‎ ‎②引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前被分解。‎ ‎(4)将目的基因导入受体细胞后，还需对转基因植物进行目的基因的检测与鉴定。‎ 解析：(1)马铃薯是双子叶植物，常用农杆菌转化法将目的基因导入马铃薯受体细胞中。构建好的基因表达载体基本结构有：目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点五部分。‎ ‎(2)马铃薯易患多种疾病，导致产量下降。基因工程中常用的抗病基因为病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因、几丁质酶基因和抗毒素合成基因(写一种即可)。‎ ‎(3)科学家还培育出抗除草剂的转基因马铃薯，主要从两个方面进行设计：‎ ‎①修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感，或使靶蛋白过量表达，植物吸收除草剂后仍能正常代谢。‎ ‎②引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前被分解。‎ ‎(4)将目的基因导入受体细胞后，还需对转基因植物进行目的基因的检测与鉴定。‎ 考点四　DNA的粗提取与鉴定 ‎1.　DNA和蛋白质在不同NaCl溶液中溶解度的比较 ‎ ‎2.　DNA的粗提取与鉴定中的“2、3、4” ‎ 某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：‎ 材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 ℃条件下，另一组置于－20 ℃条件下，保存24 h。‎ DNA粗提取：‎ 第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。‎ 第二步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。‎ 第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol/L的NaCl溶液溶解上述絮状物。‎ DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂。混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表：‎ 材料保存温度 花菜 辣椒 蒜黄 ‎20 ℃‎ ‎＋＋‎ ‎＋‎ ‎＋＋＋‎ ‎－20 ℃‎ ‎＋＋＋‎ ‎＋＋‎ ‎＋＋＋＋‎ ‎(注：“＋”越多表示蓝色越深。)‎ 分析上述实验过程，回答下列问题：‎ ‎(1)该探究性实验课题名称是探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。‎ ‎(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少DNA断裂。‎ ‎(3)根据实验结果，得出结论并分析。‎ ‎①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量较多。‎ 结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄提取的DNA量最多。‎ ‎②针对结论1，请提出合理的解释：低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢。‎ ‎(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液。然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。‎ 解析：‎ 本题考查DNA粗提取技术的原理、操作过程及分析、判断能力，从题目实验步骤看出，该实验的课题是探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。在第二步中，为了减少DNA断裂，要缓缓地搅拌。从表中结果看出，由于低温抑制了相关酶的活性，DNA降解慢，使得相同材料在低温保存下的DNA提取量大。在相同条件下，蒜黄蓝色最深，说明相同条件下从蒜黄中提取的DNA量最多。由于氯仿密度比水大，可使蛋白质变性沉淀，而与水、DNA不相溶，这样可将第三步获得的溶液与等量的氯仿混合，静置一段时间，吸取上清液。‎ ‎1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。‎ ‎2．质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。‎ ‎3．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。‎ ‎4．培育转基因动物时，受体细胞必须是受精卵，培育转基因植物时的受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。‎ ‎5．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。‎ ‎6．目的基因到了另一种生物体内能够成功表达的原理是所有生物共用一套遗传密码。‎ ‎ ‎ 限制酶是一类酶，而不是一种酶。‎ ‎ ‎ 将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。‎ ‎ ‎ 不同DNA分子用同一种限制酶切割，产生的末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的末端一般不相同。‎ ‎ ‎ 限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。‎ ‎ ‎ 基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜上载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。‎ ‎ ‎ 基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。‎ ‎ ‎ ‎①基因表达载体中，启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA)；②基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。‎ ‎ ‎ 目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因的插入位点应在启动子与终止子之间。‎ ‎ ‎ 受体细胞选择时需注意：要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。‎ ‎1．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：‎ ‎(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(答出两点即可)。‎ ‎(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白(或噬菌体蛋白)组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。‎ ‎(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。‎ 解析：本题主要考查基因工程的相关知识。(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞，且重组质粒在不同细胞中能正常表达，说明目的基因在不同细胞中的表达机制相同，生物界共用一套遗传密码。(2)基因工程中，受体细胞为大肠杆菌细胞时，常用Ca2＋处理大肠杆菌，使之处于感受态，即Ca2＋参与的转化法。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。因噬菌体的宿主是细菌，故只有细菌可作为重组噬菌体的宿主细胞。(3)为防止目的基因表达的蛋白质被破坏，可选用不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保护蛋白质不被水解。‎ ‎2．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下。图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。‎ 回答下列问题：‎ ‎(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是E1和E4。使用这两种酶进行酶切是为了保证甲的完整，也是为了保证甲与载体正确连接。‎ ‎(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。‎ ‎(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中、体外培养、胚胎移植等。‎ ‎(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。‎ 解析：(1)构建基因表达载体时，使用的限制酶不能破坏融合基因。选用产生不同黏性末端的两种限制酶，可以防止自身环化，并且保证融合基因和质粒正确连接。(2)在牛的皮肤细胞中观察到绿色荧光，说明L1基因已经表达，即在该皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。(3)培育转基因的克隆牛需将含目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中。(4)为检测克隆牛的不同组织细胞中是否含有融合基因，需提取不同组织细胞的核DNA作为PCR模板，用PCR方法进行鉴定。‎ ‎3．(2017·全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：‎ ‎(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是 基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A。‎ ‎(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕。‎ ‎(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快，容易培养(答出两点即可)等优点。‎ ‎(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是蛋白A的抗体(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。‎ ‎(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导。如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么这一启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。‎ 解析：本题主要考查了基因工程的相关知识。(1)人体基因A有内含子，将获得的基因A导入大肠杆菌中，经过转录得到含有内含子对应序列的mRNA，因为大肠杆菌没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。内含子部分对应的mRNA序列阻断了蛋白A的合成。‎ ‎(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，选用昆虫病毒作为载体，不选用噬菌体作载体的原因是噬菌体的宿主细胞是细菌，噬菌体不能侵染家蚕。‎ ‎(3)大肠杆菌是原核生物，原核生物作为受体细胞，有以下优点：结构简单、繁殖速度快、容易培养等。‎ ‎(4)要检测基因A是否翻译出蛋白A，最准确的方法是利用蛋白A的抗体，因抗体具有特异性，一种抗体只能与特定的蛋白质结合，可根据蛋白A抗体的杂交情况来判断是否合成了蛋白A。‎ ‎(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中将一种生物个体的DNA转移到了另一种生物个体中，并表达合成了相应的蛋白质。‎ ‎4．(2017·全国卷Ⅱ)‎ 几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：‎ ‎(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。‎ ‎(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。‎ ‎(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点；目的基因无表达所需的启动子(答出两点即可)。‎ ‎(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。‎ ‎(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。‎ 解析：(1)嫩叶相对于老叶，细胞壁较薄，较易破碎，容易提取几丁质酶的mRNA；由于RNA酶可降解RNA，提取RNA时，提取液中应添加RNA酶抑制剂，以防止所提取的RNA降解。‎ ‎(2)以mRNA为模板、4种脱氧核苷酸为原料，在逆转录酶的作用下，按照碱基互补配对原则，mRNA可通过逆转录合成cDNA。‎ ‎(3)目的基因中缺乏表达所需要的复制原点、启动子等，而质粒载体中含有，为了使目的基因在受体细胞中表达，应将目的基因与质粒载体形成重组质粒，导入受体细胞。‎ ‎(4)DNA连接酶可将同种限制酶切割产生的末端连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。‎ ‎(5)几丁质酶基因整合到植物基因组中，但植物抗真菌病的能力没有提高，说明几丁质酶基因在植物细胞中未表达。依据中心法则可知，基因表达包括转录和翻译两个过程，可能是目的基因的转录或翻译过程异常导致目的基因在受体细胞中未表达，进而导致植物抗真菌病的能力没有提高。‎ ‎5．(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：‎ ‎(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。‎ ‎(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长；并且含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)的细胞也是不能区分的，其原因是二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基。‎ ‎(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自受体细胞。‎ 解析：本题考查基因工程的相关知识。‎ ‎(1)质粒被选用为基因工程的载体是因为：具有一个或多个限制酶切点；具有自我复制能力；带有标记基因；对宿主细胞无害。‎ ‎(2)未转化的和仅含环状目的基因的细胞都不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，故这两种不可区分。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长，这两种也不可区分。因目的基因插入位点在四环素抗性基因上，四环素抗性基因被破坏，在获得的单个菌落中各挑取少许分别接种到含有四环素的培养基上，不能生长的为要筛选的菌落，即含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。‎ ‎(3)噬菌体营寄生生活，能利用宿主细胞内的原料和场所进行自身DNA的复制和蛋白质的合成。‎ ‎6．(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。‎ 图(a)‎ 根据基因工程的有关知识，回答下列问题：‎ ‎(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3A_Ⅰ酶切后的产物连接，理由是两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端。‎ ‎(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有甲和丙，不能表达的原因是 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案亦可)。‎ ‎(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有E·coli_DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。‎ 解析：本题主要考查限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用及基因表达载体的构建。‎ ‎(1)BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ的共同识别序列是—GATC—，二者切割形成的黏性末端相同，可以被DNA连接酶连接。‎ ‎(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的前端，终止子应位于目的基因的后端，这样目的基因才能顺利地转录并完成翻译过程，即顺利表达，图中所示甲、丙均不符。‎ ‎(3)常见的DNA连接酶有T4DNA连接酶和E·coli DNA连接酶，T4DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。‎ 学习至此，请完成课时作业36‎