高考生物一轮复习第十单元生物技术与工程第34讲基因工程ⅠDNA的粗提取与鉴定及其PCR技术课件 45页

第 34 讲　基因工程 ( Ⅰ )DNA 的 粗提取与鉴定及其 PCR 技术 生物技术与工程 （选择性必修 3 ） 第十单元 等级考 (2017 级 ) 课标要求 内容标准 活动要求 1 ． DNA 的粗提取和鉴定。 2 ．利用聚合酶链式反应 (PCR) 扩增 DNA 片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟 PCR 实验。 ① DNA 与蛋白质在物理、化学性质方面的差异如下： 比较项目 DNA 蛋白质 溶解性 2 mol/L NaCl 溶液中 析出 0.14 mol/LNaCl 溶液中 酒精溶液中 耐受性 蛋白酶 无影响 水解 高温 _____℃ 以上变性 不能忍受 __________ ℃ 的高温 溶解 析出 溶解 析出 溶解 80 60 ～ 80 ② 洗涤剂能够瓦解 __________ ，但对 DNA 没有影响。 (2) 鉴定原理： DNA 在 ________ 条件下，遇二苯胺会被染成 ____ 色。 细胞膜 沸水浴 蓝 DNA 含量相对较高 蒸馏水 洗涤剂 (3) 去 除 滤 液 中 的 杂 质 NaCl 溶液 嫩肉粉 木瓜蛋白 水浴箱 酒精 静置 白色丝状物 玻璃棒 丝状物 2 mol/L 丝状物 NaCl 溶液 二苯胺 沸水浴 变蓝 4 ． 操作提示 (1) 实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血的主要原因是 _________________ ____________________ 。为防止血液凝固需要加入 ____________ 。 (2) 实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，玻璃容器吸附 DNA ，会使提取到的 DNA 更少。 (3) 破碎细胞，释放 DNA 的过程中，若实验材料是鸡血细胞液，则加水后必须充分搅拌，目的是 _____________________________________ 。 DNA 主要存在于 鸡血细胞的细胞核内 柠檬酸钠 使鸡血细胞充分破碎完全释放出 DNA (4) 加入洗涤剂后，动作要 ______________ ，否则容易产生大量的 _______ ，不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免 _________ _____________ ，导致 DNA 分子不能形成 _______________ 。 (5) 用酒精浓缩和沉淀 DNA 时，所用的体积分数为 95% 的酒精必须 ___________ 后才能使用，冷却酒精与含有 DNA 的氯化钠溶液的体积比是 1 ∶ 1 。 (6) 常温下，二苯胺试剂要 ____________ ，否则会影响鉴定的效果。 轻缓、柔和 泡沫 加剧 DNA 分子的断裂 絮状沉淀 充分预冷 现配现用 [ 归纳整合 ] 1 ． 实验中两次加入蒸馏水的目的 第一次加入是在 “ 破碎细胞，获取含 DNA 的滤液 ” 步骤中，加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破；第二次加入是在 “ 去除滤液中的杂质 ” 步骤中，加入的目的是稀释 NaCl 溶液，使 DNA 逐渐析出。 2 ． 实验中三次使用 2 mol/L 的 NaCl 溶液的目的 实验中有三次使用 2 mol /L 的 NaCl 溶液，作用均为溶解 DNA 。第一次是向滤液中加入 NaCl ，使 NaCl 溶液的物质的量浓度为 2 mol/ L ；第二次和第三次均是直接用物质的量浓度为 2 mol/L 的 NaCl 溶液溶解含 DNA 的丝状物。 3. 实验中四次过滤的比较 项目 第一次过滤 第二次过滤 第三次过滤 第四次过滤 滤液中 含 DNA 的核物质 DNA 溶于 0.14mol/L 的 NaCl 溶液的杂质 DNA 纱布上 细胞膜、核膜等残片 不溶于 2 mol/L 的 NaCl 溶液的杂质 含 DNA 的黏稠物 不溶于 2 mol/L 的 NaCl 溶液的杂质 过滤前加入的物质 蒸馏水 NaCl 溶液 蒸馏水 NaCl 溶液 过滤 目的 去除细胞膜、核膜等杂质 去除不溶于 2 mol/L 的 NaCl 溶液的杂质 去除溶于 0.14 mol/L 的 NaCl 溶液的杂质 去除不溶于 2 mol/L 的 NaCl 溶液的杂质 [ 思维探究 ] 下面为 “ DNA 的粗提取与鉴定 ” 实验的一些重要操作示意图，据图回答下列有关该实验的问题： (1) 用箭头和字母表示出正确的操作顺序。 提示： C → B → E → D → A 。 (2) 上图 C 、 E 步骤都加入蒸馏水，但其目的不同，那么分别是什么？ 提示： C 的目的是加速鸡血细胞的破裂； E 的目的是降低 NaCl 溶液的浓度，使 DNA 析出。 (3) 图 A 步骤中所用酒精必须经充分冷却才能使用，该步骤的目的是什么？ 提示： 提取含杂质少的 DNA 。 (4) 为鉴定 A 中所得到的丝状物的主要成分为 DNA ，说出鉴定方法，并预测结果和结论。 提示： 可滴加二苯胺试剂并沸水浴。如果出现蓝色，则该丝状物的主要成分为 DNA 。 [ 教材深挖 ] 1 ．教材选修 1P 55 “ 旁栏思考题 ” ：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 提示： 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂 ( 细胞膜和核膜的破裂 ) ，从而释放出 DNA 。 2 ．教材选修 1P 55 “ 旁栏思考题 ” ：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 提示： 洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于 DNA 的释放；食盐的主要成分是 NaCl ，有利于 DNA 的溶解。 命题点一　 DNA 的粗提取与鉴定的实验原理 1 ． (2019 · 河北衡水校级月考 ) 下列关于 “ DNA 的粗提取与鉴定 ” 实验的原理的叙述，正确的是 ( 　　 ) A ．可用猪血作为实验材料，原因是猪血红细胞的细胞核中 DNA 含量多 B ．利用 “ DNA 在 2 mol/L 的 NaCl 溶液中溶解度最低，易析出 ” 的特性提取 DNA C ．利用 “ DNA 不溶于酒精，而细胞中的某些蛋白质可溶于酒精 ” 的特性提纯 DNA D ．利用 “ DNA 与二苯胺作用而显现紫色 ” 的特性鉴定 DNA Ｃ 解析 　 猪血红细胞不含细胞核和各种细胞器， A 错误； DNA 在 2 mol/ L 的 NaCl 溶液中溶解度较高， B 错误；利用 “ DNA 不溶于酒精，而细胞中的某些蛋白质可溶于酒精 ” 的特性提纯 DNA ， C 正确；在沸水浴条件下， DNA 与二苯胺反应呈现蓝色， D 错误。 命题点二　 DNA 粗提取与鉴定的实验设计 2 ． (2019 · 江苏南通模拟 ) 在利用鸡血进行 “ DNA 的粗提取与鉴定 ” 的实验中，下列叙述正确的是 ( 　　 ) A ．用蒸馏水将 NaCl 溶液浓度调至 0.14mol/L ，滤去析出物 B ．调节 NaCl 溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质 C ．将丝状物溶解在 2 mol/L NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色 D ．由于 DNA 对高温耐受性较差，故需向 DNA 滤液中加入冷酒精 B 解析 　 DNA 在浓度为 0.14 mol/ L 的 NaCl 溶液中的溶解度最低，因此用蒸馏水将 NaCl 溶液浓度调至 0.14 mol /L ， DNA 析出，过滤去除溶液中的杂质， A 错误；根据 DNA 和蛋白质的溶解度以及对酶的耐受性不同，调节 NaCl 溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质， B 正确；将丝状物溶解在 2 mol/ L 的 NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂后要经沸水浴加热后才能呈现蓝色， C 错误；由于 DNA 不溶于酒精，细胞中的某些蛋白质溶于酒精，因此需向 DNA 滤液中加入冷酒精以进一步纯化 DNA ， D 错误。 3. 如图为 “ DNA 的粗提取与鉴定 ” 实验的相关操作。分析回答： (1) 图中实验材料 A 可以是 ____________ 等，研磨前加入的 B 应该是 _________________ 。 (2) 通过上述所示步骤得到滤液 C 后，再向滤液中加入 2 mol/L 的 NaCl 溶液的目的是 __________________ ，再过滤得到滤液 D ，向滤液 D 中加入蒸馏水的目的是 ___________________________________________________ 。 洋葱 ( 菜花 ) 洗涤剂和食盐 使 DNA 溶解 使 DNA( 溶解度下降而沉淀 ) 析出，除去可溶性杂质 (3) 在 “ DNA 的粗提取与鉴定 ” 实验中，将含有一定杂质的 DNA 丝状物分别放入体积为 2 mL 的 4 种溶液中，经搅拌后过滤，获得如表所示的 4 种滤液，含 DNA 最少的是滤液 ______ 。 1 B 液中 搅拌、研磨后过滤 滤液 E 2 2 mol/L 的 NaCl 溶液中 搅拌后过滤 滤液 F 3 0.14 mol/L 的 NaCl 溶液中 搅拌后过滤 滤液 G 4 冷却的 95% 的酒精溶液中 搅拌后过滤 滤液 H H 解析 　 (1) 用洋葱、菜花等破碎细胞时，加入一定量的洗涤剂和食盐，洗涤剂可以溶解细胞膜，有利于 DNA 的释放，食盐的主要成分是 NaCl ，有利于 DNA 的溶解。 (2) 在含有 DNA 的滤液中，加入 2 mol /L 的 NaCl 溶液，可以使 DNA 溶解而杂质析出；在滤液 D 中加入蒸馏水，当 NaCl 溶液浓度为 0.14 mol/ L 时， DNA 溶解度最小而析出，除去可溶性杂质。 (3) 在滤液 E 中，只是除去了部分杂质，则含 DNA 较多；在滤液 F 中，除去了较多的蛋白质等，则含 DNA 最多；在滤液 G 中，因 DNA 析出，则含 DNA 较少；在滤液 H 中，因 DNA 不溶于体积分数为 95% 的冷酒精溶液，则含 DNA 最少。 1 ． 细胞内 DNA 复制的条件和 PCR 扩增的原理 (1) 细胞内 DNA 复制的条件 考点二　多聚酶链式反应扩增 DNA 片段 原料 4 种 ________________ 模板 2 条 DNA 母链 酶 解旋酶和 ________________ 能量 由 ATP 提供 引物 使 DNA 聚合酶能够从引物的 _________ 开始连接脱氧核苷酸 脱氧核苷酸 DNA 聚合酶 3 ′ 端 (2)PCR 扩增的原理 ① 多聚酶链式反应，即 _______ 技术，是一种 _______ 迅速扩增 DNA 的技术。 ② DNA _________ 原理，即： ③子链的延伸方向为从 ______ __ 到 ________ 。 ④条件： DNA 模板、分别与两条模板相结合的 __________ 、四种脱氧核苷酸、耐热的 ________________ 、稳定的 __________ 、能自动调控温度的温控设备。 PCR 体外 热变性 变性 冷却 5′ 端 3′ 端 两个引物 Taq DNA 聚合酶 缓冲液 2 ． PCR 的反应过程和实验操作 (1)PCR 的反应过程 PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为 ___________________ 三步。 ① 变性： 当温度上升到 _______ 以上时，双链 DNA 解旋为单链。 ② 复性： 当温度下降到 50 ℃ 左右时，两种引物通过 _____________ 与两条单链 DNA 结合。 ③ 延伸： 当温度上升到 72 ℃ 左右时，在 ____________ 的作用下，溶液中的四种脱氧核苷酸通过 _______________ 合成新的 DNA 链。 变性、复性和延伸 90 ℃ 碱基互补配对 DNA 复合酶 碱基互补配对 (2) 实验用具与操作 ① 实验用具 (a)PCR 仪：能自动调控 _______ ，实现 DNA 的扩增。如果没有 PCR 仪，可用 3 个 _____________________ 代替。 (b) 微量离心管：总容积为 0.5 mL ，实际上是进行 _____________________ 。 (c) 微量移液器：用于向微量离心管中转移 PCR 配方中的液体。 温度 恒温水浴锅 PCR _ 反应的场所 ② 实验操作程序 准备：按照 PCR 反应体系配方将需要的试剂摆放在实验桌上 ↓ 移液：用 ________________ 按照配方向微量离心管中依次加入各组分 ↓ _____ ：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀 ↓ 离心： ↓ 反应：将离心管放入 _________ 中进行反应 微量移液器 混合 将微量离心管放在离心机上，离心约 10 s ， 目的是 __________________________ 使反应液集中在离心管底部 PCR 仪 3 ． 操作提示与 DNA 含量的测量 (1) 操作提示 ① 为避免外源 DNA 等因素的污染，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行 _____________ 。 ② 缓冲液和酶应分装成小份，并在 __________ 条件下储存。 ③ 每添加一种试剂后，移液器上的枪头必须 _______ 。 ④ 混合均匀后要 _______ 处理，使反应液集中在离心管底部。 (2)DNA 含量的测定 ① 原理： DNA 在 __________________ 波段有一强烈的吸收峰。 ② 计算公式： DNA 含量 (μg/mL) ＝ 50 × ________________ ×__________ 。 高压灭菌 － 20 ℃ 更换 离心 260 nm 的紫外线 (260 nm 的读数 ) 稀释倍数 [ 归纳整合 ] 1 ． DNA 的复制方向 图 1 脱氧核糖属于五碳糖，每个脱氧核糖上有 5 个碳原子，与每个碳原子相连接的化学基团并不完全相同。为区别不同的碳原子，科学家给每个碳原子编上了号码。在脱氧核糖核苷酸中，五个碳原子的编号如图 1 所示。在 DNA 单链中将磷酸基团的末端称为 5 ′ 端，将含有羟基 ( — OH) 的末端称为 3 ′ 端，如图 2 所示： 图 2 DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA ，而只能从 3′ 端延伸 DNA 链，所以 DNA 的合成方向总是从子链的 5′ 端向 3′ 端延伸。 2 ． 细胞内 DNA 复制和细胞外 PCR 扩增的比较 DNA 复制 PCR 扩增 不同点 场所 活细胞内 细胞外 能量 ATP 提供能量 不需 ATP 提供能量 酶 解旋酶、 DNA 聚合酶 耐热 DNA 聚合酶 ( Taq DNA 聚合酶 ) 是否有 RNA 合成 伴有 RNA 合成，产生引物 无 RNA 合成，需加入两种引物 是否需缓冲液 不需缓冲液 严格配制 10 倍浓缩的扩增缓冲液 设备 无 严格控制温度变化的温控设备 相同点 原料 四种脱氧核苷酸 ( 含 A 、 T 、 G 、 C) 复制原理 严格遵循碱基互补配对原则，半保留复制 模板 以 DNA 为模板 引物 都需要与两条模板链相结合的两种引物 [ 思维探究 ] 下图为 PCR 技术的过程示意图，请回答： (1)PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环可分为哪三个步骤？ 提示： 变性、复制、延伸。 (2)PCR 技术需要哪些必要条件？ 提示： PCR 技术的必要条件，除了模板、原料、酶以外，至少还需要三个条件，即液体环境、适宜的温度和引物。 (3) 根据设计，一分子 DNA 经 30 次循环后，应得到约 2 30 个 DNA 分子，但结果只有约 2 10 个 DNA 分子。出现该现象的原因可能有哪些？ 提示： 循环次数不够； Taq DNA 聚合酶活力不够或其活性受到抑制；系统设计欠妥。 [ 教材深挖 ] (1) 教材 P 58 左下角相关信息：引物的实质是什么？ DNA 复制时为什么需要引物？ 提示： 引物是一小段 DNA 或 RNA ，它能与 DNA 母链的一段碱基序列互补配对，用于 PCR 的引物长度通常为 20 ～ 30 个核苷酸。 DNA 聚合酶不能从头合成 DNA ，而只能从 3 ′ 端延伸 DNA 链，因此 DNA 复制需要引物。 (2) 教材 P 63 练习 2 ：如果要使用 PCR 扩增一段已知的 DNA 序列，你打算如何设计引物？ 提示： PCR 引物是根据需要扩增的目标 DNA 的碱基序列来设计的。 命题点一　 PCR 的原理与反应过程 1 ．下列关于 DNA 聚合酶催化合成 DNA 子链的说法，正确的是 ( 　　 ) A ．以 DNA 为模板，使 DNA 子链从引物的 3′ 端开始延伸的一种酶 B ． Taq DNA 聚合酶在每次高温变性处理后都必须再添加 C ． DNA 聚合酶能特异性地复制 DNA 的全部序列 D ． Taq DNA 聚合酶是从深海生态系统中发现的 A 解析 　 DNA 聚合酶不能从头开始催化合成 DNA ，而只能使子链从引物的 3 ′ 端延伸， A 正确； Taq DNA 聚合酶能耐高温，所以在反应体系中可被反复利用，无需另外再添加， B 错误； PCR 扩增的是两个引物之间的固定长度的 DNA 序列， C 错误； Taq DNA 聚合酶是从水生耐热细菌 Taq 中分离得到的，该菌发现于美国黄石国家公园的一个热泉中， D 错误。 2 ．实验室中模拟生物体内 DNA 复制必需的一组条件是 ( 　　 ) ① 耐高温的 DNA 聚合酶　 ② 游离的脱氧核苷酸　 ③ 引物　 ④ DNA 模板　 ⑤ mRNA 　 ⑥ tRNA 　 ⑦ 适宜的温度　 ⑧ 适宜的酸碱度　 ⑨ 解旋酶 A ． ①②③④⑤⑥⑨ 　　　　　 B ． ②③④⑤⑥⑦⑨ C ． ②③④⑤⑦⑧⑨ D ． ①②③④⑦⑧ D 解析 　 mRNA 是翻译的模板， tRNA 是翻译的 “ 搬运工 ” ，二者在基因的表达中用到，而在 PCR 过程中不需要。解旋酶在细胞内 DNA 复制时用到，但在 PCR 过程中不需要， PCR 是通过加热来使 DNA 解螺旋的。 命题点二　 PCR 的操作过程 3 ．使用 PCR 仪的具体实验操作顺序应为 ( 　　 ) ① 设计好 PCR 仪的循环程序　 ② 按配方准备好各组分　 ③ 用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分　 ④ 进行 PCR 反应　 ⑤ 离心使反应液集中在离心管底部 A ． ②③⑤④① B ． ①⑤③②④ C ． ②③⑤①④ D ． ④②⑤③① Ｃ 解析 　 使用 PCR 仪的操作步骤一般分为准备 ( 包括配制配方及将各配方放于实验台上 ) 、移液、混合、离心、反应。 PCR 仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。 4 ． (2019 · 广东湛江期中 ) 下列关于 PCR 操作过程的叙述错误的是 ( 　　 ) A ． PCR 实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌 B ． PCR 缓冲液和酶应分装成小份，在－ 20 ℃ 储存 C ． PCR 所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 D ．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换 Ｃ 解析 　 PCR 实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭茵， A 正确； PCR 缓冲液和酶应分装成小份，在－ 20 ℃ 储存， B 正确； PCR 所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能使缓冲液中稳定性较差的成分和酶的活性不被破坏， C 错误；在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换， D 正确。 1 ．酵母和菜花均可作为提取 DNA 的材料 ( ) 2 ． DNA 既溶于 2 mol/L NaCl 溶液也溶于蒸馏水 ( ) 3 ．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物 ( ) 4 ．利用 DNA 溶于酒精，而蛋白质不溶于酒精，可将 DNA 与蛋白质分离 ( ) 5 利用高温能使蛋白质变性，却对 DNA 没有影响的特性，可将 DNA 与蛋白质分离 ( ) 课堂小结 · 内化体系 ……………………………………………………………………………………………………………… ◎ √ 　 √　 × × × 　 6 ．在溶有 DNA 的物质的量浓度为 2 mol/L 的氯化钠溶液中缓缓加入蒸馏水，轻轻搅拌后过滤，取滤液进行以后的实验 ( ) 7 ．在 DNA 滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可将 DNA 与蛋白质分离 ( ) 8 ． PCR 反应所需要的引物只是 RNA ( ) 9.PCR 反应所需要的原料是核糖核苷酸 ( ) 10 ． PCR 反应所需要的酶在 60 ℃ 会变性 ( ) 11 ． PCR 反应需要在一定的缓冲溶液中进行 ( ) × 　 √ × 　 × 　 × 　 √ 1 ． DNA 粗提取与鉴定的实验选材 (1) 选用鸡血作实验材料的原因：鸡血中 DNA 含量丰富，价格便宜，材料易得；鸡血细胞极易吸水涨破。 (2) 哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和细胞器，不含 DNA ，不适合作本实验的材料。 (3) 若使用植物细胞作为实验材料 ( 以洋葱为例 ) ，破碎细胞获取含 DNA 的滤液的方法：在切碎的洋葱中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分地搅拌和研磨，然后过滤收集研磨液。 ……………………………………………………………………………………………………………… ◎ 2 ． DNA 的粗提取与鉴定过程中的相关试剂 (1) 柠檬酸钠：在用血液作为实验材料时使用，作为抗凝剂，防止血液凝固。 (2) 洗涤剂：在用植物细胞作为实验材料时使用，能够瓦解细胞膜，利于 DNA 的释放。 (3) 食盐：加速核蛋白解聚，游离出 DNA 分子。 (4) 酒精：体积分数为 95% 的冷却的酒精，可抑制核酸水解酶活性，防止 DNA 降解；降低分子运动，使 DNA 易形成沉淀析出；低温还利于增加 DNA 分子的柔韧性，减少断裂。 (5) 二苯胺试剂：要现配现用，否则会影响鉴定效果。鉴定时，溶液蓝色的深浅与溶液中 DNA 含量的多少有关。 3 ． PCR 技术的三点提醒 (1)PCR 反应需要适宜但不同于细胞内 DNA 复制的条件，如 PCR 反应不需要添加解旋酶和 ATP ，但需要添加耐热的 DNA 聚合酶以及能够人为控制温度和复制周期等。 (2) 体内 DNA 复制与 PCR 反应的主要不同点： ① PCR 过程需要的引物多为人工合成的 DNA 单链或 RNA ，其长度通常为 20 ～ 30 个核苷酸； ② PCR 过程中 DNA 的解旋不是依靠解旋酶完成的，而是通过对反应温度的控制来完成的。 (3)PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过控制温度来控制 DNA 双链的解聚与结合。 PCR 技术中的温度控制是关键，解答此类问题要清楚 PCR 过程中的温度变化。