高中生物第四章生物化学与分子生物学技术实践第9课时生物成分的分离与测定技术同步备课教学案苏教版选修1 20页

真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 1 第 9 课时 生物 成分的分离与测定技术 [学习导航] 1.掌握电泳法分离大分子的原理。2.运用常用的方法提取和分离蛋白质。3.尝 试从血清中提取和分离血红蛋白。4.了解芳香油的特点，知道提取芳香油的原理及会设计简 单的实验装置进行提取。 [重难点击] 1.电泳法分离大分子的原理。2.运用常用的方法提取和分离蛋白质。 一、蛋白质的分离与纯化 1.分离与测定生物成分中蛋白质的技术包括离心沉降法、薄膜透析法、凝胶色谱法和电泳法 等。采用醋酸纤维薄膜电泳的方法可以将所带电荷的数量和性质不同的蛋白质从混合样品中 分离并纯化出来；采用水蒸气蒸馏法和脂溶性有机溶剂提取法可以分离生物组织中的脂肪。 2.蛋白质分离的抽提方法 3.蛋白质的分离方法 (1)离心沉降法：通过控制离心速度，使分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层。 (2)薄膜透析法：利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，使蛋白质与其他小分子化合物分离 的方法。 (3)凝胶色谱法 ①概念：根据蛋白质分子量的大小差异对其进行有效分离的方法。 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 2 ②原理 a.凝胶 形态：微小的多孔球体 组成：大多由多糖类化合物构成 结构：内部具有很细微的多孔网状结构 b.分离的过程 项目 进入凝胶颗粒内部的程度 路程 移动速度 小分子蛋白质 容易 较长 较慢 大分子蛋白质 无法进入 较短 较快 (4)蒸馏 ①概念：将液体加热至沸腾，使液体变为蒸气，然后使蒸气冷却再凝结为液体，这两个过程 的联合操作称为蒸馏，是分离和提纯液态混合物常用的方法之一。 ②分离物质的种类 a.易挥发和不易挥发的物质。 b.液体混合物中沸点不同的物质。 (5)电泳法：将所带电荷的数量和性质不同的蛋白质从混合样品中分离并纯化出来。 欲研究某种蛋白质的结构、性质和功能，需将这种蛋白质从组织细胞中分离、纯化出来。结 合教材，完成下列内容： 1.怎样释放细胞中的蛋白质？ 答案 在提取蛋白质时，可以采用研磨和超声波结合的方法将生物组织或细胞完全破碎，使 蛋白质从细胞中释放出来，并使其溶解在适当的抽提液中。 2.离心沉降法分离蛋白质 (1)完善下面离心沉降法分离蛋白质的示意图 (2)观察并总结离心沉降法分离的原理及其目的：通过控制离心速度，使分子大小、密度不同 的蛋白质发生沉降分层，从而达到分离出不同种类蛋白质的目的。 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 3 3.薄膜透析法分离蛋白质 仔细观察下面薄膜透析法分离蛋白质的示意图，完成下列问题： 利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，从而使蛋白质与其他小分子化合物分离开，达到纯 化蛋白质的目的。 4.凝胶色谱法 (1)结合上图，根据凝胶色谱法的分离原理，填表分析不同大小的分子洗脱后的次序。 项目 相对分子质量大 相对分子质量小 直径大小 较大 较小 运动方式 垂直向下运动 无规则的扩散运动 运动路程 较短 较长 运动速度 较快 较慢 洗脱次序 先流出 后流出 (2)结合上图，分析为什么相对分子质量较大的蛋白质会先从色谱柱中洗脱出来？ 答案 相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部，而被滞留；相对分子质 量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。 (3)凝胶色谱法分离蛋白质时通过一次洗脱能否将所需蛋白质与其他杂质彻底分离？ 答案 不能。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，移动距离较近，移动速度 较快，先洗脱出来；但相对分子质量较小的蛋白质可能进入凝胶颗粒内部，也可能不进入， 导致部分相对分子质量较小的蛋白质可能与相对分子质量较大的蛋白质一起洗脱出来。 1.凝胶色谱法分离蛋白质时由色谱柱下端最先流出的是( ) 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 4 A.相对分子质量较小的蛋白质 B.相对分子质量较大的蛋白质 C.凝胶颗粒 D.葡萄糖或琼脂糖分子 答案 B 解析 凝胶色谱法分离蛋白质的原理是依据蛋白质分子相对分子质量的大小，相对分子质量 大的蛋白质分子不能进入凝胶内部的通道，路程较短，移动速度快，先洗脱出来；相对分子 质量小的蛋白质分子能够进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度慢，后洗脱出来，因此 最先流出的应是相对分子质量较大的蛋白质，而凝胶颗粒是不能流出的。 2.蛋白质的分离与纯化是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述不正确的是( ) A.根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离 B.根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等，可通过电泳法分离蛋白质 C.根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质 D.根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质 问题导析 (1)薄膜透析法是利用了蛋白质分子不能透过半透膜的特性，将蛋白质与其他小 分子物质(如无机盐、单糖、二糖以及氨基酸)分离开来的提纯方法。 (2)蛋白质所带电荷的性质能决定其在电泳槽中的移动方向，分子的大小能影响其移动速度。 (3)凝胶色谱法是根据蛋白质分子量的大小差异对其进行有效分离的方法。 (4)离心沉降法是通过控制离心速度，使分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层，从而达 到分离出不同种类蛋白质的目的。 答案 A 解析 蛋白质分子是生物大分子，都不能通过半透膜，因此不能利用半透膜分离蛋白质。 一题多变 (1)本题四个选项涉及的提纯方法中，哪种不适合将不同种类的蛋白质分离？为什么？ 答案 薄膜透析法。因为薄膜透析法的原理是根据蛋白质不能通过半透膜的特性，该方法仅 可将蛋白质与其他一些小分子物质分离，而不适合将不同种类的蛋白质分离。 (2)电泳法中影响蛋白质移动速度的因素除了分子大小外，还有哪些因素？ 答案 颗粒的大小、形状和所带净电荷的多少，此外还有电场强度、溶液的 pH 等因素。 归纳总结 蛋白质分离技术的原理 (1)薄膜透析法：蛋白质水溶液具有亲水胶体溶液性质，不能透过半透膜。 (2)离心沉降法：在离心力的作用下，分子大小、密度不同的蛋白质分子沉降速度不同，从而 被分离。 (3)凝胶色谱法：凝胶小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进 入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 5 小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢，因此可将 各种相对分子质量不同的蛋白质分离。 (4)电泳法：不同的物质所带电荷不同，颗粒的大小、形状不同，因此，在电场中的泳动速度 不同。 二、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 1.结合教材，完善下表 实验步骤 操作方法 配制试剂 配制巴比妥缓冲液、染色液、漂洗液、透明液 准备器材 醋酸纤维薄膜、常压电泳仪、点样器等 架滤纸桥 取双层滤纸条，一端与支架前沿对齐，另一端浸入电泳槽的缓冲液中， 待滤纸条湿润后，驱除气泡，使滤纸紧贴于支架上 浸泡薄膜 用镊子夹取醋酸纤维薄膜，识别出光泽面，并在光泽面的一角用笔做 上记号，然后放在巴比妥缓冲液中浸泡 20 min 细心点样 取出薄膜，吸去多余液体，平铺在玻璃板上，有记号的一面朝下，点 样时将盖玻片在血清中蘸一下，在薄膜一端 2 cm 处轻轻按下，点上细 条状的血清样品，随即提起 平悬薄膜 将点样端平贴在电泳槽负极支架的滤纸桥上，有记号的一面朝上，另 一端平贴于正极，呈绷直状态 实施电泳 盖上电泳槽盖，在醋酸纤维薄膜平衡约 10 min 后接通电源，电泳 60～ 90 min 染色 取下薄膜，放入染色液中浸泡 5～10 min 漂洗 取出薄膜，在漂洗液中漂洗数次，直至蛋白质区底色脱净为止 脱色 用滤纸压平并吸干薄膜，再浸入透明液中约 5 min，取出后平贴于玻 璃板上，待完全干燥后便成透明薄膜图谱 2.实验结果 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 6 1.本实验的关键步骤是点样，点样的技术要求有哪些？ 答案 点样前，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散；但不宜太干， 否则样品不易进入膜内，造成点样起始参差不齐，影响分离效果。 2.实验结果分析 (1)血清蛋白主要包括几种蛋白质？含量大小如何？ 答案 从电泳图谱示意图中可以看出：血清蛋白主要包括五种蛋白质，且含量最多的是清蛋 白，其他依次是：γ－球蛋白＞α1－球蛋白＞α2－球蛋白＞β－球蛋白。 (2)这些蛋白质带什么电荷？四种球蛋白的泳动速度如何？ 答案 由五种蛋白质所处的位置可判断出它们均带有负电荷，四种球蛋白在电场中的泳动速 度由快到慢依次为：α1－球蛋白＞α2－球蛋白＞β－球蛋白＞γ－球蛋白。 归纳提炼 关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的几点说明 (1)薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 (2)点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。 (3)点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。 (4)点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适中，不宜过多或过少。 (5)电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。 (6)应控制染色时间。时间过长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带 染色不均匀，必要时可进行复染。 3.仔细观察下图，所带负电荷最少的球蛋白是( ) A.α1－球蛋白 B.α2－球蛋白 C.β－球蛋白 D.γ－球蛋白 答案 D 解析 对于几种球蛋白来说直径相差不大，引起泳动速度的差异主要来自于所带电荷多少， 由图可知球蛋白由右向左泳动，因右侧为负极，且γ－球蛋白距点样处最近，所以γ－球蛋 白所带负电荷最少。 规律方法 电泳的泳动规律 带电颗粒直径越小、越接近于球形，所带净电荷越多，则在电场中的泳动速度越快；反之， 则越慢。 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 7 4.下列关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的说法中，不正确的是( ) A.架滤纸桥时，待滤纸条湿润后，要驱除气泡，以便使滤纸紧贴于支架上 B.浸泡薄膜时要识别出光泽面，并做记号 C.平悬薄膜时，有记号的一面朝上 D.从染色液中取出薄膜后，用滤纸条压平并吸干，再浸入透明液中脱色 答案 D 解析 薄膜染色后要先放入漂洗液中漂洗直至蛋白质区底色脱净为止，然后才用透明液脱色。 三、凝胶色谱法分离血红蛋白 1.研究目标 (1)红细胞中含有大量的血红蛋白，一分子血红蛋白由四条肽链构成(两条α－肽链和两条β －肽链)，由于其肽链中结合了血红素而呈现出红色。 (2)可利用哺乳动物血液分离血红蛋白。 2.实验器材 猪、羊等血液；色谱柱；交联葡聚糖凝胶，20 mmol/L 磷酸缓冲液等。 3.实验目的 利用凝胶色谱法分离血红蛋白。 4.实验步骤 (1)样品处理：低速短时间离心分离红细胞。 用滴管吸出上层血浆后，将下层红细胞倒入盛有约 5 倍体积的质量分数为 0.9%的 NaCl 溶液 (生理盐水)的烧杯中搅拌后再低速离心，重复 3 次，直到红细胞被洗净，上清液不再呈现黄 色为止。 (2)血红蛋白的释放、分离和透析 ①在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂而释放出血红蛋白。 ②将混合液以 2 000 r/min 的速度离心 10 min，试管中形成 4 层(自上而下分别为甲苯层、 脂溶性物质层、血红蛋白层、杂质层)；用滤纸过滤其中的液体，除去脂溶性沉淀层；用分液 漏斗分离出下层的红色透明液体(血红蛋白溶液)。 ③在透析袋中加入 1 mL 红色透明液体，放入物质的量浓度为 20 mmol/L 的磷酸缓冲液中(pH 为 7.0)透析 12 h。 (3)凝胶的制备 将交联葡聚糖凝胶用蒸馏水充分溶胀后，制成凝胶悬浮液。凝胶的溶胀一定要完全，否则会 导致色谱柱装填不均匀，并产生气泡。 (4)色谱柱的装填 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 8 ①将层析柱洗净，垂直固定在支架上，选择有薄膜(100 目尼龙纱)端作为层析柱下口。 ②打开色谱柱下端的乳胶管开口，将充分溶胀的凝胶悬浮液轻轻搅动均匀，沿层析柱内壁缓 缓一次性倒入色谱柱内。 ③立即连接洗脱瓶，在约 50 cm 高的操作压下，用洗脱液(pH 为 7.0，物质的量浓度为 20 mmol/L 的磷酸缓冲液)充分洗涤平衡凝胶 12 h，使凝胶装填紧密。 (5)样品的加入 ①打开色谱柱下端的流出口，让凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面刚好平行，关闭出口。 ②用滴管小心吸取 1 mL 样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱顶端，不能破坏凝胶面。然后， 打开流出口，使样品液逐渐渗入凝胶。 ③当样品恰好完全渗入凝胶床时，再加入少量的洗脱液(pH 为 7.0，物质的量浓度为 20 mmol/L 的磷酸缓冲液)冲洗管壁。重复数次，每次既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶床 面干燥而发生裂缝。随后可慢慢地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱，直至洗脱液到适当高度。(注 意：整个过程一定要仔细，避免破坏凝胶柱的床层。) (6)洗脱与收集 连接好凝胶柱层析系统，调节洗脱液流速为每分钟 1 mL，进行洗脱。仔细观察样品在层析柱 内的分离现象，当红色的蛋白质接近色谱柱的出口时，收集洗脱液，每收集 5 mL 即换一支收 集管(要预先编号)，连续收集，样品即可完全被洗脱下来。 小贴士 1对色谱柱填料处理时，因凝胶是干燥的，须将其置于洗脱液中使其充分膨胀，在 此期间，可以通过加热等方法使其膨胀速度加快，这也有利于排除胶粒内的空气，避免凝胶 凝固后出现气泡而影响分离效果。 2色谱柱的装填时，装柱过程中严禁产生气泡，一旦发现气泡，必须重装。 3洗脱过程中，注意不能让洗脱液流干而露出凝胶颗粒，否则需重新装填色谱粒。 5.结论与反思 观察红色区带在洗脱过程中的移动状况，如果红色区带均匀一致地移动，并且凝胶色谱柱中 没有气泡产生，说明色谱柱的装填是成功的。 6.深入研究 若需对蛋白质纯度进行鉴定，一般采用 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 (1)该方法以聚丙烯酰胺凝胶(为网状结构，具有分子筛效应)作为支持介质。 (2)SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要微克量级的蛋白质即可完成鉴 定。 (3)蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带的净电荷、分子的大小和形 状等因素。 向蛋白质溶液中加入足够量的 SDS(十二烷基磺酸钠)等，可使蛋白质分子中的二硫键还原。 十二烷基硫酸根所带的负电荷使各种蛋白质—SDS 复合物都带上大大超过了蛋白质分子原有 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 9 的负电荷量。SDS 与蛋白质的结合还可引起蛋白质构象改变，使不同蛋白质的 SDS 复合物的 短轴长度都一样。这样，蛋白质—SDS 复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形 状的影响，而仅仅取决于分子量的大小。 (4)由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子蛋白质可以很容易地通过凝胶孔，阻力小，迁移速 度快；大分子蛋白质则因受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会因其分子 量的不同而被分离。 1.实验操作过程 (1)材料的选择：与其他真核细胞相比，哺乳动物成熟红细胞有什么特点？这一特点对你进行 蛋白质的分离有什么意义？ 答案 ①哺乳动物成熟红细胞内没有细胞核和各种复杂细胞器，排除了其他物质对实验结果 的干扰。②血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候 应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 (2)洗涤红细胞的目的是什么？你如何知道红细胞已洗涤干净？ 答案 洗涤的目的是去除血浆蛋白；离心后的上清液不再呈现黄色，证明红细胞已洗涤干净。 (3)在血红蛋白释放过程中，蒸馏水和甲苯的作用分别是什么？ 答案 ①蒸馏水可以使红细胞吸水涨破，释放细胞内的血红蛋白；②甲苯是有机溶剂，可以 溶解细胞膜，有助于血红蛋白的释放。 (4)血红蛋白释放后的混合液经离心后分为哪几层？如何获得血红蛋白溶液？ 答案 ①分为 4 层：从上往下数，第 1 层为无色透明的有机溶剂(甲苯)，第 2 层为白色的脂 类物质，第 3 层为红色透明的血红蛋白溶液，第 4 层为暗红色的红细胞破碎物沉淀。 ②分层的液体→过滤除去脂溶性沉淀层→分液得下层的血红蛋白溶液。 (5)将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析，透析的目的是什么？ 答案 血红蛋白是大分子物质，不能透过透析袋，这样可以去除相对分子质量较小的杂质。 2.凝胶色谱操作 (1)在制作凝胶色谱柱时，凝胶色谱柱的高度不足或直径过大对洗脱效果分别有何影响？ 答案 ①凝胶色谱柱的高度是样品随缓冲溶液流过的距离，凝胶色谱柱的高度不足会导致达 不到分离效果； ②凝胶色谱柱的直径大小并不影响分离效果，但直径过大会导致洗脱液体积大，样品稀释度 大，使实验现象不明显。 (2)试从凝胶色谱的分离原理分析，凝胶的装填为什么要紧密、均匀？ 答案 如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶 内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的洗脱次序，影响分离的效果。 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 10 (3)在装填凝胶柱时，如果有气泡存在，会对蛋白质的分离有何影响？ 答案 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 归纳总结 血红蛋白的提取和分离各操作的主要目的 操作 目的 红细胞的洗涤 去除杂蛋白，如血浆蛋白 血红蛋白的释放 使红细胞破裂，释放血红蛋白 分离血红蛋白溶液 经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开 透析 除去样品中相对分子质量较小的杂质 纯化 除去相对分子质量较大的杂质蛋白质 5.下列关于凝胶色谱法分离血红蛋白实验中样品的加入和洗脱的叙述中，不正确的是( ) A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B.用吸管小心地将 1 mL 透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面 C.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 D.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 答案 A 解析 加样前，应打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面 平齐，关闭出口，而不应使缓冲液下降到凝胶面的下面，A 项不正确。加样时不要破坏凝胶 面，B 项正确。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，C 项正确。等样品完全进入凝 胶层后，关闭下端出口，再加缓冲液，D 项正确。 6.下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图分析回答下列问题： (1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质 具有 功能。 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 11 (2)甲装置用于 ，目的是去除样品中 的杂质，图中 A 是 。 B 是 溶液。 (3)用乙装置分离蛋白质的方法叫 ，是根据 分离蛋白质 的有效方法。 (4)乙装置中，C 是 ，其作用是 。 (5)用乙装置分离血红蛋白时，待 时，用试管收集流出液，每 5 mL 收集 一管，连续收集 6 管，图中试管序号表示收集的先后。经检测发现，试管②和试管⑤中蛋白 质含量最高，则试管⑤中的蛋白质相对分子质量比血红蛋白 (填“大”或“小”)。 答案 (1)运输 (2)透析(粗分离) 相对分子质量较小 磷酸缓冲液 血红蛋白 (3)凝胶色谱法 相对分子质量的大小 (4)磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白 (5)红色的蛋白质接近色谱柱的出口 小 解析 (1)血红蛋白能携带氧气，体现了蛋白质具有运输功能。(2)甲装置为透析装置，目的 是去除样品中相对分子质量较小的杂质。其中 A 是磷酸缓冲液，B 是血红蛋白溶液。(3)乙装 置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法，是根据蛋白质的相对分子质量大小分离蛋白质的有效方 法。(4)乙装置中，C 溶液为磷酸缓冲液，作用是洗脱血红蛋白。(5)待红色的蛋白质接近色 谱柱出口时，用试管收集流出液，每 5 mL 收集一管，连续收集。最先收集到的蛋白质是血红 蛋白分子，则试管②内的大量蛋白质为血红蛋白。由于试管⑤晚于试管②收集得到， 因此其 内收集到的蛋白质比血红蛋白分子移动速度慢，其相对分子质量比血红蛋白小。 规律方法 凝胶色谱法分离蛋白质中确定收集蛋白质时间的方法 (1)血红蛋白的收集：利用血红蛋白的颜色，当红色的蛋白质接近色谱柱出口时，就要收集流 出液。 (2)其他无色蛋白质的收集：可以在实验时加入指示剂以掌握样品的移动位置，确定最佳的收 集时机。 四、从生物材料中提取某些特定成分 1.植物芳香油的特点 (1)具有挥发性，故可用水蒸气蒸馏法提取。 (2)易溶于有机溶剂，故可采用萃取法提取芳香油。 2.提取橘皮中的芳香油 (1)橘皮芳香油的成分及用途 ①成分：橘皮芳香油的主要成分是柠檬烯。 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 12 ②用途：橘皮芳香油是生产食用香精、化妆品香精和医药香精的优质原料。 (2)提取方法：橘皮芳香油存在于果皮的油细胞中，具有一定的挥发性，其沸点低于水的沸点。 在蒸馏时，随着温度的升高和水分的侵入，果皮油细胞涨破，芳香油流出并随水一起形成蒸 气，蒸气再通过冷凝管，经接液管流入收集瓶。由于油轻水重，静置后分离。 1.适合用水蒸气蒸馏法提取的成分应具有怎样的特性？ 答案 适用于具有挥发性的，能随水蒸气蒸发而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶 于水的成分的提取。 2.在水中蒸馏的操作中，如何避免加热时发生暴沸？ 答案 蒸馏烧瓶下垫石棉网，并向液体中加入几片碎石或瓷片。 3.为什么冷凝管中水流应从下方进水，上方出水？ 答案 与蒸气流向相反，冷却效果好。 4.为什么液体混合物中各组分的沸点如果相差不大就不适合采用蒸馏的方法提取？ 答案 若各组分的沸点相差不大，在蒸馏时会同时蒸发出，达不到分离的效果，所以不适合 采用蒸馏的方法进行分离。 归纳拓展 植物芳香油的提取方法 提取方法 提取原理 方法步骤 适用范围 水蒸气蒸馏法 利 用 水 蒸 气 将 挥 发 性 较 强 的 植 物 芳香油携带出来 ①水蒸气蒸馏 ②分离油层 ③除水过滤 适用于提取玫瑰油、薄 荷油等挥发性较强的 芳香油 压榨法 通过机械加压，压 榨 出 果 皮 中 的 芳 香油 ①石灰水浸泡、漂洗 ②压榨、过滤、静置 ③再次过滤 适用于柑橘、柠檬等易 焦糊原料的提取 有机溶剂萃取法 使 提 取 物 溶 解 在 有机溶剂中，蒸发 后得到提取物 ①粉碎、干燥 ②萃取、过滤 ③浓缩 适用范围广，要求原料 的颗粒要尽可能细小， 能充分浸泡在有机溶 剂中 7.下列属于植物芳香油理化性质的是( ) ①具有较强的挥发性 ②易溶于水 ③易溶于有机溶剂 ④具有特殊的植物香味 A.①②③ B.②③④ 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 13 C.①③④ D.①②④ 答案 C 解析 植物芳香油是植物有效成分的提取液，其特点是具有特殊的植物香味和较强的挥发性， 且难溶于水，易溶于有机溶剂。 8.蒸馏装置安装完毕后，可以在蒸馏瓶中加几粒沸石，目的是( ) A.加速沸腾 B.防止液体过度沸腾 C.减缓沸腾 D.防止蒸馏瓶炸裂 答案 B 1.下列关于蛋白质提取的叙述中，不正确的是( ) A.分离与纯化蛋白质之前首先要用适当的方法使蛋白质释放出来 B.抽提时要依据蛋白质的不同特性选择不同的溶剂 C.蛋白质的粗提取物离心可除去一些小分子杂质 D.蛋白质的粗制品可能是多种蛋白质的混合物 答案 C 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 14 解析 对抽提得到的粗提取物离心可除去固体杂质。 2.离心沉降法是纯化蛋白质的方法之一，在这一过程中蛋白质会分层，这一现象与蛋白质的 何种性质有关( ) A.酸碱性 B.所带电荷多少 C.分子大小和密度 D.种类 答案 C 解析 根据蛋白质之间或蛋白质与其他分子之间在分子大小和密度上的不同，采用离心沉降 法，使其分层而分离。 3.下列关于植物芳香油的描述，正确的是( ) A.易挥发、沸点高、易溶于水 B.不挥发、沸点高、易溶于有机溶剂 C.不挥发、沸点低、易溶于水 D.易挥发、沸点低、易溶于有机溶剂 答案 D 解析 植物芳香油具有较强的挥发性，其沸点比水低，不溶于水，易溶于有机溶剂，因此可 用有机溶剂来提取。 4.下列关于电泳概念的理解，错误的是( ) A.能进行电泳的物质一般是带电颗粒 B.带电颗粒向着与其电性相同的电极移动 C.影响泳动速度的因素包括带电颗粒的性质、电场强度、溶液的 pH 等 D.电泳支持物有滤纸、大分子凝胶、醋酸纤维薄膜等 答案 B 解析 电泳是指带电颗粒向着与其电性相反的电极移动的现象。 5.回答下列有关蛋白质分离和纯化的问题： (1)要获得血清蛋白的粗制品，必须将含有柠檬酸钠的血液进行 处理，然后将 装入透析袋中除去 。 (2)要获得血红蛋白，应如何破碎红细胞？ 。 (3)下图为血清蛋白通过醋酸纤维薄膜的电泳图谱，你认为含量最多的蛋白质是 ， 含负电荷最多的球蛋白是 ，相对分子质量最大的球蛋白是 。 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 15 (4)电泳是目前应用最为普遍的 蛋白质的方法。 答案 (1)离心 上清液 小分子物质 (2)加入蒸馏水使其涨破 (3)清蛋白 α1－球蛋白 γ－球蛋白 (4)(分离)纯化 课时作业 [学考达标] 1.在水蒸气蒸馏装置中，从进水口通入水的作用是( ) A.加热 B.防止过度沸腾 C.过滤 D.冷凝 答案 D 解析 在使用水蒸气蒸馏法提取植物芳香油时，需要用到蒸馏装置，在装置中，进、出水口 之间的水是不断流动的，以降低装置温度，使水蒸气与芳香油混合物冷却成为液体，便于分 离。 2.下列关于植物芳香油的说法，错误的是( ) A.可溶于水，所以可以用蒸馏法提取 B.具有较强的挥发性，能随水蒸气一起蒸发 C.提取方法主要有蒸馏法、压榨法和萃取法 D.蒸馏时，流入收集瓶中的乳浊液分层，上层为芳香油，下层为水 答案 A 解析 植物芳香油为脂溶性物质，不溶于水，而易溶于有机溶剂。 3.为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂( ) A.NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠 答案 D 4.带电荷的蛋白质在电场中移动的速度主要取决于( ) A.所带的电荷多少 B.蛋白质的分子大小 C.蛋白质相对分子质量 D.蛋白质的分子大小和所带的电荷多少 答案 D 5.电泳过程中什么样的分子迁移速度最快( ) A.纤维状、大分子 B.纤维状、小分子 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 16 C.球状、大分子 D.球状、小分子 答案 D 解析 在电泳过程中，分子迁移速度主要取决于分离样品中各种分子带电性质的差异以及分 子本身的大小、形状的不同。一般来说，球状分子比纤维状分子易移动，小分子比大分子易 移动。 6.用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质( ) A.路程较长，移动速度较慢 B.路程较长，移动速度较快 C.路程较短，移动速度较慢 D.路程较短，移动速度较快 答案 D 解析 凝胶颗粒内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分 子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量 较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。 [高考提能] 7.凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可以用此方法进行 分离，能分离的蛋白质分子之间必须( ) A.具有相同的相对分子质量 B.相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子 C.相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子 D.具有不同的相对分子质量 答案 C 解析 若在凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难被分离的。对于分 子的大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的，分 子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶。 8.如图是用已除去 DNA 的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验的装置，下列有关叙述不正确 的是( ) 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 17 A.首先用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较大的杂质 B.图乙装置的试管收集到的液体中最先得到的是相对分子质量较大的蛋白质 C.用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 管收集 5 mL，连续收集 D.图丙装置可用于电泳法分离提纯血红蛋白 答案 A 解析 用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质；图乙装置表示 通过凝胶色谱法分离蛋白质的过程，蛋白质的相对分子质量较大被排阻在凝胶颗粒的外面， 在颗粒之间迅速通过。 9.工业生产上，植物芳香油的提取常采用水蒸气蒸馏法，其原因是( ) A.利用水蒸气可将挥发性强的植物芳香油携带出来 B.水蒸气蒸馏法可分为水中蒸馏、水上蒸馏和水气蒸馏 C.植物芳香油挥发性强，易溶于有机溶剂 D.操作最简单，成本较低 答案 D 解析 在工业生产中，提取芳香油的原理与实验室提取的原理相同，只是在工业生产中，要 考虑生产成本和操作过程等问题。在各种提取方法中，因为水蒸气蒸馏法的成本低，操作简 单而常被工业生产采用。 10.利用水蒸气蒸馏法提取茉莉精油的正确步骤是( ) A.鲜茉莉花＋清水→水蒸气蒸馏→除水→分离油层→茉莉油 B.鲜茉莉花＋清水→水蒸气蒸馏→油水混合物→分离油层→除水→茉莉油 C.鲜茉莉花＋清水→除水→水蒸气蒸馏→油水混合物→分离油层→茉莉油 D.鲜茉莉花＋清水→分离油层→除水→水蒸气蒸馏→茉莉油 答案 B 解析 用水蒸气蒸馏法提取茉莉精油时，应先将新鲜的茉莉花与清水共沸进行蒸馏，然后在 得到的油水混合物中加入氯化钠使之分层，再进行分液，为除去茉莉油中仍存在的水分，可 加入无水硫酸钠，过滤后可以得到较纯的茉莉油。 11.蛋白质分子中，氨基酸的α－氨基和α－羧基虽然大部分结合成为肽键，但是蛋白质分子 内仍含有各种酸性基团和碱性基团，如肽链末端的α－氨基和α－羧基、天冬氨酸和谷氨酸 残基中的羧基、赖氨酸和组氨酸残基中的各种碱性基团，所以蛋白质是两性电解质。在酸性 溶液中，碱性基团的解离增大，使蛋白质带正电荷；在碱性溶液中，酸性基团的解离加强， 使蛋白质带负电荷。当溶液到达某一 pH 时，蛋白质可因内部酸性和碱性基团的解离相等而呈 等电状态，这时的溶液 pH 叫做蛋白质的等电点。不处于等电点状态的蛋白质分子的正、负电 荷量是不相同的。请回答下列问题： 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 18 (1)多数蛋白质的等电点接近于 5，一般含碱性基团较多的蛋白质的等电点 (“偏 高”还是“偏低”)。 (2)根据等电点的不同，可用 法将不同种类的蛋白质分子分开。 (3)简述根据等电点分离不同种类的蛋白质分子的原理。 。 答案 (1)偏高 (2)电泳 (3)不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋 白质大部分或全部被沉淀下来 解析 含碱性基团较多的蛋白质溶液，在 pH 接近于 5 时解离程度较大，蛋白质带正电荷。要 使蛋白质内部酸性和碱性基团解离相等呈等电状态，必须提高溶液的 pH，使酸性基团解离增 加，故蛋白质的等电点提高。根据等电点不同，可以利用电泳法将特定的蛋白质分离出来。 12.通过对橘皮芳香油提取过程的学习，请你自己设计一个提取茉莉油的过程，请回答下列问 题： (1)第一步，采摘原料，提炼茉莉油的原料为 ，要在盛花期采收，此时， 茉莉油的含量较高。 (2)提取茉莉油常采用 法，此方法是通过水分子向原料中渗透， 使 ，形成精油与水的共沸物，蒸馏出 的水蒸气与精油通过 、 后得到精油。 (3)下图是茉莉油的生产工艺，请回答： 茉莉花＋水 ↓ 蒸馏器→ A → B →油水混合物→ C →直接精油→加 D →过滤→茉莉油 ①向蒸馏器中加入原料时，茉莉花与清水的质量比大约为 。 ②A 表示 过程，B 表示 过程，C 表示 。通过 C 提取 出的直接精油，可能还混有一定的水分，所以要向提取液中加入 D 吸水， 放置过夜，再过滤除去固体物质，即可得到茉莉油。 答案 (1)茉莉花 (2)水蒸气蒸馏 植物中精油成分向水中扩散 冷凝 油水分离 (3)①1∶4 ②水蒸气蒸馏 冷凝 分离油层 无水硫酸钠 13.血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中 O2 或 CO2 的运输。请根 据血红蛋白的提取和分离流程图回答下列问题： 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 19 (1)将实验流程补充完整：A 为 ，B 为 。 凝胶色谱法是根据 而达到蛋白质分离的有效方法。 (2)洗涤红细胞的目的是去除 ，洗涤次数过少，无法除去 ；离心速 度过高和时间过长会使 一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净 的标志是 。释放血红蛋白的过程中起作用的是 。 (3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为 20 mmol/L 的磷酸缓冲液(pH 为 7.0)的目的是 。 如果红色区带 ，说明色谱柱制作成功。 答案 (1)血红蛋白的释放 样品的加入和洗脱 相对分子质量的大小 (2)杂蛋白(血浆蛋白) 血浆蛋白 白细胞和淋巴细胞 离心后的上清液中没有黄色 蒸馏 水和甲苯 (3)准确模拟生物体内的生理环境，保持体外溶液的 pH 和体内环境中的 pH 基本一致 均匀一 致地移动 解析 凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，在蛋白质提取与分离 过程中包括样品的处理、粗分离、纯化和纯度鉴定四步，每一步均应用了不同的操作技术， 需要注意。 [真题体验] 14.(2011·海南，30)许多植物含有天然香料，如薄荷叶中含有薄荷油。现用薄荷叶提取薄荷 油。 回答问题： (1)薄荷油是挥发性物质，提取薄荷油时应选用 (鲜、干)薄荷叶作原料，其原因 是 。 (2)用萃取法提取薄荷油时，采用的溶剂是 ，原理是 。 (3)用水蒸气蒸馏法提取薄荷油时，在油水混合物中加入氯化钠的作用是 。 常用于分离油层和水层的器皿是 。分离出的油层中加入无水硫酸钠的作用 是 ，除去固体硫酸钠的常用方法是 。 答案 (1)鲜 薄荷油易挥发，鲜薄荷叶中薄荷油含量高 (2)乙醚 薄荷油易溶于有机溶剂，且乙醚沸点低、易蒸发 真正的价值并不在人生的舞台上,而在我们扮演的角色中。 20 (3)增加盐的浓度，使分层更明显 分液漏斗 吸去油层中的水分 过滤 15.(2011·广东，5)以下关于猪血红蛋白提纯的描述中，不正确的是( ) A.洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂 B.猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少 C.血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测 D.在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢 答案 D 解析 生理盐水和红细胞内的溶液为等渗溶液，A 正确；各种细胞器和细胞核中都含有蛋白 质，所以不含有细胞器和细胞核的红细胞内，蛋白质种类较少，提纯时杂蛋白较少，B 正确； 血红蛋白有颜色，所以在凝胶色谱法分离过程中易分辨，可用于监测，C 正确；凝胶色谱法 分离蛋白质，分子量较小的易进入凝胶内部，移动速度比较慢，故血红蛋白比分子量较小的 杂蛋白移动快，D 错误。