【生物】2020届 一轮复习 人教版 基因工程 学案 23页

‎2020届 一轮复习 人教版 基因工程 学案　‎ ‎　1.基因工程的诞生(Ⅰ)。　2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)。　3.基因工程的应用(Ⅱ)。　4.蛋白质工程(Ⅰ)。‎ 考点一　基因工程的基本工具 ‎ ‎ ‎1．基因工程的概念 ‎(1)供体：提供目的基因。‎ ‎(2)操作环境：体外。‎ ‎(3)操作水平：分子水平。‎ ‎(4)原理：基因重组。‎ ‎(5)受体：表达目的基因。‎ ‎(6)本质：性状在受体体内的表达。‎ ‎(7)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。‎ ‎2．基因工程的操作工具 ‎(1)限制酶 ‎(2)DNA连接酶 ‎①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。‎ ‎②类型 常用类型 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 ‎③DNA连接酶和限制酶的关系 ‎(3)载体 ‎①‎ ‎②其他载体：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。‎ ‎③载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。‎ ‎[归纳整合]‎ ‎1．限制酶的特点与使用 ‎(1)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。‎ ‎(2)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。‎ ‎(3)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。‎ ‎2．与DNA相关的五种酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA (水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 ‎3．全面理解基因工程中的载体 ‎(1)应具备的条件：‎ ‎①能在受体细胞中复制并稳定保存，可使目的基因稳定存在且数量可扩大。‎ ‎②具有一个至多个限制酶切点，可供外源DNA片段插入。‎ ‎③具有标记基因，可供重组DNA的鉴定和选择。 ‎ ‎(2)与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。‎ ‎[思维探究]‎ 据两种限制酶的作用图示思考相关问题：‎ ‎(1)已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。‎ 提示：‎ ‎(2)图①和②产出的末端类型有什么不同？‎ 提示：①产生的是黏性末端；②产生的是平末端。‎ ‎(3)EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同，说明限制酶具有怎样的特性？‎ 提示：专一性。‎ ‎[教材深挖]‎ 教材选修3 P4“寻根问底”：根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？‎ 提示：限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。‎ 命题点一　限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用 ‎ 1.(2016·全国卷Ⅲ，T40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。‎ 图(a)‎ 图(b)‎ 根据基因工程的有关知识，回答下列问题：‎ ‎(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是________________________________________‎ ‎________________________________________。‎ ‎(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是_________________________________________________。‎ 图(c)‎ ‎(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________和________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________。‎ 解析　　(1)由题图可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。‎ 答案　　(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案也可)‎ ‎(3)E.coli DNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶(其他合理答案也可)‎ ‎2．(2019·四川乐山一模)为了解基因结构，通常选取一特定长度的线性DNA分子，先用一种限制酶切割，通过电泳技术将单酶水解片段分离，计算相对大小；然后再用另一种酶对单酶水解片段进行降解，分析片段大小。下表是某小组进行的相关实验。‎ 已知第一线性DNA序列共有5000bp ‎(bp为碱基对)‎ 第一步水解 产物(单位bp)‎ 第二步水解 产物(单位bp)‎ A酶切割 ‎3 500‎ 将第一步水解产物分离后，分别用B酶切割 ‎1500 2000‎ ‎1 000‎ ‎1 000‎ ‎500‎ ‎500‎ B酶切割 ‎2 000‎ 将第一步水 解产物分离 后，分别用 A酶切割 ‎500 1500‎ ‎3 000‎ ‎2000 1000‎ 经A酶和 B酶同时切割 ‎2000 1500 1000 500‎ ‎(1)该实验中体现出限制酶的作用特点是______________________。‎ ‎(2)由实验可知，在这段已知序列上，A酶与B酶的识别序列分别为______个和_____个。‎ ‎(3)根据表中数据，请在下图中用箭头标出相应限制酶的酶切位点。‎ ‎(4)已知BamH I与BglⅡ的识别序列及切割位点如下图所示，用这两种酶和DNA连接酶对一段含有数个BamHI和BglⅡ识别序列的DNA分子进行反复的切割、连接操作，若干次循环后和___________序列明显增多，该过程中DNA连接酶催化____________键的形成。‎ 解析　(1)该实验中体现出限制酶的作用特点是酶的专一性。‎ ‎(2)A酶切割后形成3段，所以有2个识别位点，B酶切割后形成2段，所以有1个切割位点。‎ ‎(3)由于酶B只有一个限制酶切位点，即在2000和3000之间，可以先标注出；又由于酶A又可以将2000的这段切成500和1500的，结合酶A单独切割又可以标注其切割位点，同理标出另一个切割位点，答案如下图：‎ ‎(4)巳知BamHⅠ与BglⅡ的识别序列及切割位点如图2所示。用这两种酶和DNA连接酶对一段含有数个BamHⅠ和BglⅡ识别序列的DNA分子进行反复的切割、连接操作，若干循环后和序列明显增多。DNA连接酶催化形成的是磷酸二酯键。‎ 答案　(1)一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，且在特定的位点切割 ‎(2)2　1‎ ‎(3)‎ ‎(4)　磷酸二酯键 限制酶的选择方法 根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。‎ ‎(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ 。‎ ‎(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ 。‎ ‎(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。‎ 命题点二　载体的应用分析 ‎3．(2016·全国卷Ⅰ，T40)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：‎ ‎(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。‎ ‎(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_________________；并且________________和________________的细胞也是不能区分的，其原因是__________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。‎ ‎(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________。‎ 解析　(1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。‎ 答案　(1)能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)‎ ‎(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素　(3)受体细胞 ‎4．(2019·福建三明市段考)基因工程中最常用的运载体是质粒，作为运载体，需有标记基因，如抗青霉素基因、抗四环素基因等。现欲鉴别某种细菌质粒抗药性基因的类别，设计如下实验：‎ 材料用具：青霉素、四环素的10万单位溶液，菌种试管，已经灭菌的含细菌培养基的培养皿，酒精灯，接种环，一次性注射器，蒸馏水，恒温箱。‎ 方法步骤：‎ 第一步：取3个含细菌培养基的培养皿并分别标上1、2、3号，在酒精灯旁，用3只注射器分别注入1mL蒸馏水、青霉素溶液、四环素溶液，并使之分布在整个培养基表面；‎ 第二步：将接种环放在酒精灯的火焰_____(填“上”或“旁”)灼烧，并在酒精灯的火焰_____(填“上”或“旁”)取菌种，对3个培养皿分别接种；‎ 第三步：将接种后的3个培养皿放入37℃恒温箱中培养24h。‎ 请对结果进行预测：‎ ‎①若 _______________号培养基中细菌存活，说明该细菌质粒上有两种抗性基因；‎ ‎②若1号培养基中细菌存活，2、3号培养基中没有细菌存活，说明 ______________ ；‎ ‎③ ________________________________________‎ ‎________________________________________；‎ ‎④ ________________________________________ ‎ ‎________________________________________。‎ 解析　根据题意可知，本实验的目的是鉴别某种细菌质粒抗药性基因的类别，即检测转基因细菌在何种培养基中能正常生长、繁殖；根据已有的步骤安排，按照无菌操作的要求，第二步中应将接种环放在酒精灯的火焰上灼烧，并在酒精灯的火焰旁(无菌区)取菌种，对3个培养皿分别接种。若基因工程中构建完成的目的细菌中含有某种抗生素抗性基因(标记基因)，该基因正常表达，则会赋予该工程菌抵抗此抗生素的能力，这样该工程菌就可以在含有该种抗生素的培养基中正常生长、繁殖，否则工程菌不能在含有该抗生素的培养基生存；因此①若该工程菌质粒上有两种抗性基因，则细菌可在1、2、3号培养基中细菌存活；②若该工程菌质粒上两种抗性基因都没有，则细菌可在1号培养基中细菌存活，而2、3号培养基中没有细菌存活；③若该工程菌质粒上仅含有青霉素抗性基因，则细菌能在1、2号培养基中细菌存活，而在3号培养基中没有细菌存活；④若该工程菌质粒上仅含有四环素抗性基因，则细菌可在1、3号培养基中细菌存活，而2号培养基中没有细菌存活。‎ 答案　 上　旁　①1、2、3　 ②该细菌质粒上两种抗性基因都没有　③1、2号培养基中细菌存活，3号培养基中没有细菌存活，说明该细菌质粒上有青霉素抗性基因　④1、3号培养基中细菌存活，2号培养基中没有细菌存活，说明该细菌质粒上有四环素抗性基因 考点二　基因工程的操作过程与应用 ‎1．基本操作程序 ‎2．基因工程的应用 ‎(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。‎ ‎(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质。‎ ‎(3)比较基因治疗与基因诊断 原理 操作过程 进展 基因治疗 基因表达 利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)‎ 临床实验 基因诊断 碱基互补 配对 制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况 临床应用 ‎[归纳整合]‎ ‎1．几种获取目的基因方法的比较 方法 从基因文库中获取 人工合成 从基因组文 从部分基因 化学合成法 逆转录法 库中获取 文库，如cDNA 文库中获取 过程 供体细胞 中的DNA ‎↓限制酶 许多DNA片段 ‎↓插入 载体 ‎↓导入 受体菌群 ‎(基因组文库)‎ ‎↓分离 目的基因 目的基因 的mRNA ‎↓逆转录 单链DNA ‎↓合成 双链DNA ‎↓插入 载体 ‎↓导入 受体菌群 ‎(cDNA文库)‎ ‎↓分离 目的基因 蛋白质 的氨基 酸序列 ‎↓推测 mRNA 的核苷 酸序列 ‎↓推测 结构基 因的核 苷酸序列 ‎↓化学合成 目的基因 目的基因 的mRNA ‎↓逆转录 单链DNA ‎↓合成 双链DNA 即目的 基因 ‎2．基因工程操作程序中的“三、三、二、一”‎ ‎(1)目的基因“三种获取方法”：‎ ‎①从基因文库中获取(基因组文库、cDNA文库)；‎ ‎②利用PCR技术扩增：其实质是在体外对目的基因进行大量复制。用PCR仪控制温度：变性(90～95 ℃)→复性(55～60 ℃)→延伸(70～75 ℃)；‎ ‎③通过DNA合成仪用化学方法人工合成(用于核苷酸序列已知，且核苷酸数目较少的基因)、利用mRNA反转录法合成。‎ ‎(2)将目的基因导入受体细胞的“三种类型”：‎ ‎①导入植物细胞——农杆菌转化法(花粉管通道法、基因枪法)；‎ ‎②导入动物细胞——显微注射法(导入受精卵)；‎ ‎③导入微生物细胞——转化法。‎ ‎(3)目的基因检测与鉴定的“两个水平”：‎ ‎(4)基因工程操作的“一个核心”——基因表达载体的构建。‎ ‎[思维探究]‎ 据图分析抗虫棉的培育过程 ‎(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？‎ 提示：目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。‎ ‎(2)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？‎ 提示：采用的方法是农杆菌转化法，由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了T－DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。‎ ‎(3)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？‎ 提示：抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。‎ ‎[教材深挖]‎ 教材选修3P8“求异思维”：你能推测出mRNA反转录形成cRNA的过程大致分为哪些步骤吗？‎ 提示：第1步：mRNA在反转录酶的作用下形成RNA－DNA杂交分子，第2步：在核酸酶的作用下将RNA－DNA杂交分子中的RNA水解掉，形成RNA单链，第3步：以RNA单链为模板，在DNA聚合酶的作用下形成双链的DNA。‎ 命题点一　基因工程操作程序的分析 ‎1．(2017·全国卷Ⅰ，T38，节选)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：‎ ‎(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是______________________________________________。‎ ‎(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是________________________________________。‎ ‎(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有________(答出两点即可)等优点。‎ ‎(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。‎ ‎(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是________________________________________。‎ 解析　(1)人是真核生物，从人的基因组文库中获得的基因A有内含子，而受体细胞大肠杆菌是原核生物，原核生物基因中没有内含子，相应的就没有切除内含子对应的RNA序列的机制，故无法表达出蛋白A。‎ ‎(2)噬菌体是专一性侵染细菌的病毒，以细菌为宿主细胞，而昆虫病毒侵染的是昆虫，以昆虫为宿主细胞。家蚕属于昆虫，故应选用昆虫病毒作为载体。‎ ‎(3)与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养等优点，故要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。‎ ‎(4)检测基因A是否翻译出蛋白A，可用抗原－抗体杂交法。‎ ‎(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型细菌的DNA可以使R型细菌发生转化，说明可调控多糖荚膜产生的基因整合到了R型细菌的DNA分子中并成功得以表达。也就是说DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体并进行表达，这就为基因工程理论的建立提供了启示。‎ 答案　(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A ‎(2)噬菌体　噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕 ‎(3)繁殖快、容易培养　(4)蛋白A的抗体　(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体 ‎2．(2019·福建三明市段考)绞股蓝细胞中含有抗烟草花叶病毒(TMV)基因，可以合成一种抗TMV蛋白，叶片对TMV具有抗感染性。烟草是重要的经济作物，由于TMV的感染会导致大幅度减产。科技人员利用基因工程技术培育出了抗TMV的烟草，主要流程如图所示。‎ ‎(1)科技人员从绞股蓝细胞中提取抗TMV基因转录的mRNA时，提取液中需添加________，防止RNA的降解。‎ ‎(2)在构建重组Ti质粒时，除添加目的基因外，为了使目的基因能表达，还应该添加__________和__________。‎ ‎(3)过程⑤需应用__________技术，其原理是__________。此过程中培养基中加入卡那霉素的目的__________。‎ ‎(4)过程⑥可采取__________的方法，检测植株是否合成了抗TMV蛋白。在个体水平的鉴定过程中，可通过__________的方法来确定植株是否具有抗性。‎ 解析　(1)科技人员从绞股蓝细胞中提取抗TMV基因转录的mRNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，防止RNA的降解。‎ ‎(2)在植物基因工程中，构建重组Ti质粒时，通常要用(同种)限制酶分别切割含目的基因的DNA分子和Ti质粒，使它们产生相同的黏性末端，然后再用DNA连接酶进行连接。为了使目的基因能表达，重组质粒在组成上还应添加启动子、终止子。‎ ‎(3)⑤是把受体细胞培养成再生植株的过程，此过程要用到植物组织培养技术，其原理是植物细胞的全能性。此过程中培养基中加入卡那霉素的目的是筛选含有目的基因的再生植株(或“受体细胞”)。‎ ‎(4)检测植株是否合成了抗TMV蛋白，过程⑥可采取抗原—抗体杂交的方法，在个体水平的鉴定过程中，可通过接种烟草花叶病毒的方法来确定植株是否具有抗性，接种烟草花叶病毒后，如果烟草植株不被感染，说明其具有抗性。‎ 答案　(1)RNA酶抑制剂　(2)启动子　终止子　(3)植物组织培养　植物细胞的全能性　筛选含有目的基因的再生植株(或“受体细胞”)　(4)抗原—抗体杂交　接种烟草花叶病毒 命题点二　基因工程的应用 ‎3．(2018·全国卷Ⅰ，T38)回答下列问题：‎ ‎(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_________________________(答出两点即可)。‎ ‎(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与___‎ ‎_____组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。‎ ‎(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。‎ 解析　(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是基因工程。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。‎ ‎(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2＋参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。‎ ‎(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。‎ 答案　(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达　(2)转化　外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)　细菌　(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶 ‎4．(2019·福建福州市检测)为了有效控制水稻害虫的危害，中国农业科学院和华中农业大学合作，成功地获得了转Bt基因的二倍体水稻。该基因来源于苏云金芽孢杆菌，基因的表达产物Bt毒蛋白具有良好的杀虫效果。请回答：‎ ‎(1)若知道Bt毒蛋白的氨基酸序列，则可以推测出Bt基因的核苷酸序列，但推测出的核苷酸序列并不是唯一的，其原因是________________________________。在已知Bt基因的核苷酸序列之后，再通过___________方法获取目的基因。‎ ‎(2)获得Bt基因后，在体外可以通过___________技术进行扩增，该技术需要的条件是___________、酶、dNTP、模板，其中的酶是___________，然后构建基因表达载体。基因表达载体中除了具目的基因、启动子和终止子之外，还需具有___________。‎ ‎(3)将Bt基因导入水稻细胞中时不宜采用农杆菌转化法，最可能的原因是___________。‎ ‎(4)可采用抗虫接种实验的方法，在___________水平上鉴定Bt基因在受体植株内是否成功表达。‎ 解析　(1) 由于密码子具有简并性，导致在依据Bt毒蛋白的氨基酸序列推测出Bt基因的核苷酸序列时，推测出的核苷酸序列并不是唯一的。在已知Bt基因的核苷酸序列的前提下，可通过人工合成的方法获取目的基因。‎ ‎(2) 在体外可通过PCR技术扩增Bt基因，该技术需要的条件是引物、Taq酶(或热稳定DNA聚合酶)、dNTP、模板。基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点等。‎ ‎(3) ‎ 由于水稻是单子叶植物，而农杆菌对大多数单子叶植物没有感染能力，所以将Bt基因导入水稻细胞中时不宜采用农杆菌转化法。 ‎ ‎(4) 采用抗虫接种实验的方法来鉴定Bt基因在受体植株内是否成功表达，这属于在个体水平上进行的鉴定。‎ 答案　(1)密码子具有简并性　人工合成　(2)PCR　引物　Taq酶(或热稳定DNA聚合酶)　 标记基因和复制原点　(3)水稻是单子叶植物，而农杆菌对大多数单子叶植物没有感染能力　(4)个体 考点三　蛋白质工程 ‎1．概念理解 ‎2．基本流程 →→→ ‎3．应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。‎ ‎[归纳整合]‎ 蛋白质工程与基因工程的关系 项目 区别与联系　　‎ 蛋白质工程 基因工程 区 别 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品 结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质 联系 ‎①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程 ‎②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造 ‎[思维探究]‎ 现代生物技术并不是各自独立的，而是相互联系、相互渗透的。下图表示利用乳腺生物反应器生产某种动物蛋白的流程示意图，请分析回答下列问题：‎ ‎(1)该生产流程中应用到的现代生物技术有哪些？(写出其中两种)。‎ 提示：蛋白质工程、基因工程、胚胎移植技术(任写两种)。‎ ‎(2)图中A、B分别表示什么含义？‎ 提示：A：推测应有的氨基酸序列，B：基因表达载体。‎ ‎(3)蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质，原因是什么？‎ 提示：改造后的基因能够遗传，且改造基因易于操作。‎ ‎[教材深挖]‎ 教材选修3P27“异想天开”：为什么到目前为止还没有生产出人类需要的蛋白质的结构？‎ 提示：因为蛋白质的高级结构非常复杂，人们对蛋白质的高级结构及其在生物体内如何行使功能知之甚少。‎ 命题点一　蛋白质工程的分析 ‎ 1.(2019·湖北孝感市一模)T4溶菌酶在温度较高时易失去活性。科学家对编码T4溶菌酶的基因进行了改造，使其表达的T4溶菌酶第三位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了T4溶菌酶的耐热性。回答下列问题：‎ ‎(1)上述操作涉及的技术属于_______________工程，该技术的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→___________→___________→找到相应的脱氧核苷酸序列。‎ ‎(2)在确定目的基因的碱基序列后，可通过___________的方法获取目的基因，再利用___________技术进行扩增。‎ ‎(3)在将目的基因导入受体细胞前，要构建基因表达载体。一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有___________、___________以及标记基因等。标记基因的作用是____________________。‎ 解析　‎ ‎(1)上述过程是对基因进行改造，结果得到耐热性提高的蛋白质，因此属于蛋白质工程的范畴。技术的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相应的脱氧核苷酸序列。‎ ‎(2)在确定目的基因的碱基序列后，可通过人工合成的方法获取目的基因，再利用PCR技术进行扩增。‎ ‎(3)基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。‎ 答案　(1)蛋白质　设计预期的蛋白质结构　推测应有的氨基酸序列　(2)人工合成　PCR　(3)启动子　终止子　为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 ‎2．(2019·河南郑州调研)科学家运用基因工程技术将结核杆菌MPT64基因(能控制合成MPT64蛋白)成功导入胡萝卜细胞，最终表达出肺结核疫苗。请回答下列问题：‎ ‎(1)基因工程的核心是_________________，所用到的工具酶有__________________。‎ ‎(2)通常采用PCR技术扩增MPT64基因，前提是要_____________________，以便根据这一序列合成引物，在操作步骤中冷却至55－60℃的目的是_______________。‎ ‎(3)根据农杆菌的特点，如果将MPT64基因插入到____________，通过农杆菌的转化作用，可以使目的基因进入胡萝卜细胞，并将其插入到植物细胞中的_________________上。要确认MPT64基因是否插入胡萝卜植株中，可用___________________技术。‎ ‎(4)蛋白质工程技术是通过____________________________，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。‎ 解析　(1)基因工程的核心是基因表达载体的构建，所用到的工具酶有限制性核酸内切酶(限制酶)和DNA连接酶。‎ ‎(2)通常采用PCR技术扩增MPT64基因(目的基因)，前提是要有一段已知MPT64基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物；在操作步骤中冷却至55－60℃的目的是使引物结合到模板DNA链(或引物与模板链结合)。‎ ‎(3)农杆菌的Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。根据农杆菌的这一特点，如果将MPT64基因插入到Ti质粒的T－DNA中，通过农杆菌的转化作用，可以使目的基因进入胡萝卜细胞，并将其插入到植物细胞中的染色体DNA上。要确认MPT64基因是否插入胡萝卜植株中，可用DNA分子杂交技术。‎ ‎(4)蛋白质工程技术是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。‎ 答案　(1)基因表达载体的构建　限制性核酸内切酶(限制酶)、DNA连接酶　(2)有一段已知MPT64基因的核苷酸序列　引物结合到模板DNA链(或引物与模板链结合)　(3)Ti质粒的T－DNA　染色体DNA　DNA分子杂交　(4)基因修饰或基因合成 命题点二　蛋白质工程与基因工程的综合应用 ‎3．(2015·全国卷Ⅱ，T40)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：‎ ‎(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的___________进行改造。‎ ‎(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰_________基因或合成______基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括____________的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_______________________________。‎ ‎(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过____________和____________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，在经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物_________进行鉴定。‎ 解析　(1)由题干信息可知改造蛋白质的功能，可通过改变蛋白质的结构实现。‎ ‎(2)依据蛋白质工程的定义及题中信息可知获得P1基因的途径有修饰现有(P)基因或合成新(P1)基因。中心法则的全部内容包括：DNA的复制、RNA的复制、转录、逆转录和翻译。‎ ‎(3)蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相应的脱氧核苷酸序列。通过蛋白质工程合成的蛋白质还需要进行生物活性的鉴定即功能鉴定，看是否达到人们的需求。‎ 答案　(1)氨基酸序列(或结构)　(2)P　P1　 DNA和RNA　　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)　(3)设计蛋白质结构　 推测氨基酸序列　 功能 ‎4．(2019·河南新乡一模)干扰素是用于治疗病毒感染和癌症的免疫活性蛋白质，若人的干扰素基因在大肠杆菌内表达，产生的抗病毒性较低且保存困难，若将第17位的半胱氨酸改造为丝氨酸，则生产出的干扰素的抗病毒性是原来的100倍，且可在－70 ℃条件下保存半年，下图是构建干扰素工程菌的过程示意图。回答下列问题。‎ ‎(1)要改变干扰素的功能，可以考虑对干扰素的____________进行改造。对干扰素进行改造，也可直接对干扰素基因进行改造，其原因是______________________________。‎ ‎(2)③过程将B导入大肠杆菌，需用_______对大肠杆菌进行处理，使其处于能_______________的生理状态。‎ ‎(3)要检测B是否导入大肠杆菌，将③过程后的大肠杆菌先接种于含_______________的培养基上，然后将在该培养基上生长的大肠杆菌接种在含__________________的培养基上，在前者培养基上能生长而在后者培养基上不能生长的是导入B的工程菌。‎ ‎(4)利用图中工程菌不能生产有活性的干扰素，这是因为______________________ _____________。‎ 解析　(1)根据题干信息，若将第17位的半胱氨酸改造为丝氨酸，则生产出的干扰素的抗病毒性是原来的100倍，且在－70 ℃条件下保存半年，因此可以对干扰素的氨基酸序列进行改造。对干扰素进行改造，也可直接对干扰素基因进行改造，原因是：蛋白质的结构由基因决定，基因可以直接遗传；对基因进行改造比对蛋白质改造容易。‎ ‎(2)将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2＋处理，使大肠杆菌能吸收周围环境中的DNA，成为感受态细胞。‎ ‎(3)将③过程后的大肠杆菌进行筛选时，先用含氨苄青霉素的培养基进行培养，淘汰没有导入任何质粒的大肠杆菌，能生长的则是含有普通质粒和重组质粒(二者都含抗氨苄青霉素基因)的大肠杆菌；然后将该培养基上生长的菌落用“盖章”的方法接种到含四环素的培养基上，在含四环素的培养基上能生长的是含普通质粒的大肠杆菌，将两个培养基进行位置对照，在含氨苄青霉素的培养基上能生长，而在含四环素的培养基上该位置没有菌落出现，则属于导入重组质粒的工程菌。‎ ‎(4)干扰素是分泌蛋白，在核糖体中合成后需要经过内质网和高尔基体加工才具有生物活性，而大肠杆菌是原核生物，无内质网和高尔基体，不具备加工干扰素的能力，所以利用图中工程菌不能生产有活性的干扰素。‎ 答案　(1)氨基酸序列　 蛋白质的结构由基因决定，基因可以直接遗传；对基因进行改造比对蛋白质改造容易　(2)Ca2＋　吸收周围环境中的DNA　(3)氨苄青霉素　 四环素　(4)大肠杆菌为原核生物，无内质网和高尔基体，不具备加工干扰素的能力 ‎◎‎ ‎1．切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(×)‎ ‎2．DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来(×)‎ ‎3．E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(×)‎ ‎4．限制酶也可以识别和切割RNA(×)‎ ‎5．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(×)‎ ‎6．每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点(√)‎ ‎7．载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达(√)‎ ‎8．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列(×)‎ ‎9．抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达(√)‎ ‎10．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株(√)‎ ‎11．由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用(×)‎ ‎12．蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质(√)‎ ‎◎‎ ‎1．限制酶是一类酶，而不是一种酶。‎ ‎2．将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。‎ ‎3．不同DNA分子用同一种限制酶切割，产生的末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的末端一般不相同。‎ ‎4．限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。‎ ‎5．目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因的插入位点应在启动子与终止子之间。‎ ‎6．与启动子、终止子有关的三个易错点 启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子 ‎(1)启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别、结合的部位。‎ ‎(2)终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端。作用是使转录过程停止。‎ ‎(3)起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。‎ ‎7．受体细胞选择时需注意：要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。‎ ‎1．(2018·全国卷Ⅱ，T38)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。‎ 启动子 L1基因 GFP基因 终止子 ‎　　　　　　　 　　　　　 　　 　‎ ‎　　 　　　　　E1　　　E2　 　　 E3　　 E4‎ 回答下列问题：‎ ‎(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________。使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________。‎ ‎(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。‎ ‎(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的________中、体外培养、胚胎移植等。‎ ‎(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。‎ 解析　(1)由题意可知，L1基因和GFP基因合成了L1GFP融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将L1GFP融合基因插入质粒P0时，可用E1和E4限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。‎ ‎(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1GFP融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。‎ ‎(3)为了获得含有甲的牛，可将含有目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中，然后进行体外培养、胚胎移植等。‎ ‎(4)利用PCR技术扩增目的基因，可以检测目的基因是否存在。PCR扩增的模板是DNA。‎ 答案　(1)E1和E4　甲的完整　甲与载体正确连接　(2)转录　翻译　(3)细胞核　去核卵母细胞　(4)核DNA ‎2．(2015·全国卷Ⅰ，T40)HIV属于逆转录病毒，是艾滋病的病原体。回答下列问题：‎ ‎(1)用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时，可先提取HIV中的________，以其作为模板，在________________的作用下合成________。获取该目的蛋白的基因，构建重组表达载体，随后导入受体细胞。‎ ‎(2)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是________。该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是________。‎ ‎(3)已知某种菌导致的肺炎在健康人群中罕见，但是在艾滋病患者中却多发。引起这种现象的根本原因是HIV主要感染和破坏了患者的部分________细胞，降低了患者免疫系统的防卫功能。‎ ‎(4)人的免疫系统有________癌细胞的功能，艾滋病患者由于免疫功能缺陷，易发生恶性肿瘤。‎ 解析　‎ ‎(1)HIV是一种逆转录RNA病毒，若要获取HIV的某种蛋白质，需将HIV的遗传物质RNA提取出来，在逆转录酶的作用下合成cDNA分子即获取该目的基因。(2)抗原注入机体后，会诱导机体的免疫系统产生抗体，抗体会和抗原发生特异性结合。HIV和抗体能特异性结合，因此可以用于检测受试者血清中的HIV。(3)HIV主要感染和破坏了患者的部分免疫细胞，主要是T细胞，降低了患者免疫系统的防卫功能。(4)人的免疫系统有监控和清除癌细胞的功能。‎ 答案　(1)RNA　逆转录酶　 DNA　 (2)抗体　　 抗原抗体特异性结合　(3)T(或T淋巴)　(4)监控和清除 ‎3．(2017·全国卷Ⅱ，T38)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：‎ ‎(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_____________________________。‎ 提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是__________________ _________________________________。‎ ‎(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是___________________________________ ________________________________________________________。‎ ‎(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是________________________________________‎ ‎________________________________________‎ ‎(答出两点即可)。‎ ‎(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是________________________________________。‎ ‎(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是________________________________________。‎ 解析　(1)与老叶相比，嫩叶组织细胞易破碎，容易提取到几丁质酶的mRNA。提取RNA时，提取液中添加RNA酶抑制剂可防止RNA被RNA酶催化降解。‎ ‎(2)以mRNA为模板，按照碱基互补配对原则，在逆转录酶的作用下，通过逆转录(反转录)可以获得cDNA。‎ ‎(3)因该目的基因是通过逆转录形成的，无表达所需的启动子，也无在受体细胞内进行复制所需的复制原点等，所以在受体细胞内不能稳定存在和表达，也不能遗传下去。‎ ‎(4)构建基因表达载体时，DNA连接酶能催化目的基因和质粒载体这两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。‎ ‎(5)转基因植株的基因组中含有几丁质酶基因，但该植株抗真菌的能力并没有提高，可能是由于转录或翻译异常，即几丁质酶基因未能正常表达。‎ 答案　‎ ‎(1)嫩叶组织细胞易破碎　防止RNA降解　(2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA　(3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子　(4)磷酸二酯键　(5)目的基因的转录或翻译异常 ‎4．(新题速递)下面是一项“利用转基因番茄生产人胰岛素的方法”的专利摘要。请回答下列问题： ‎ 本发明利用转基因番茄作为生物反应器生产人胰岛素。所用的人胰岛素基因是依据植物“偏爱”的密码子来设计所含的密码子，通过某方法合成若干DNA片段，拼接而成，重组DNA分子可通过农杆菌介导的方法转入番茄中，在番茄的果实中表达人胰岛素。‎ ‎(1)此专利采用________的方法获得目的基因。获得的人胰岛素基因与人体细胞中胰岛素基因的碱基序列不同，但两者所编码的蛋白质的氨基酸序列相同，原因是____________________。要想在体外获得大量该目的基因的片段，可以采用________技术。该技术中使用的关键酶是________，原料是四种脱氧核苷酸。 ‎ ‎(2)根据上述摘要，转基因操作时所用的载体是________，载体上的________可以转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。 ‎ ‎(3)如果要检测受体细胞中是否存在目的基因，可采用________技术，再经________方法培养成个体。‎ 解析　(1)人胰岛素基因是依据植物“偏爱”的密码子来设计所含的密码子，通过某方法合成若干DNA片段拼接而成，可见，此专利是采用人工合成的方法获得目的基因(胰岛素基因)。通过人工合成而获得的人胰岛素基因与人体细胞中胰岛素基因的碱基序列不同，但两者所编码的蛋白质的氨基酸序列相同，其原因在于：虽然基因序列不同，但由于密码子具有简并性，使得基因编码的蛋白质可以相同。采用PCR技术扩增目的基因，可在体外获得大量的该目的基因的片段。在PCR技术中使用的关键酶是热稳定DNA聚合酶(或Taq酶)。　‎ ‎(2)由题意“重组DNA分子可通过农杆菌介导的方法转入番茄中”可知：在转基因操作时所用的载体是农杆菌的Ti质粒。Ti质粒上的T－DNA可以转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。 ‎ ‎(3)如果要检测受体细胞中是否存在目的基因，可采用DNA分子杂交技术。由于该受体细胞(番茄细胞)处于离体状态，所以需经组织培养方法才能将其培养成个体。‎ 答案　(1)人工合成　 密码子具有简并性，基因序列不同，蛋白质可以相同　PCR　热稳定的DNA聚合酶(或Taq酶)　(2)农杆菌的Ti质粒　TDNA　(3)DNA分子杂交　组织培养