【生物】2018届人教版一轮复习选修1第十单元第36讲基因工程教案 23页

‎[考纲要求]　1.基因工程的诞生(Ⅰ)。2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)。3.基因工程的应用(Ⅱ)。4.蛋白质工程(Ⅰ)。5.实验：DNA的粗提取和鉴定。‎ 考点一　基因工程的操作工具 ‎1．基因工程的概念 ‎(1)供体：提供目的基因。‎ ‎(2)操作环境：体外。‎ ‎(3)操作水平：分子水平。‎ ‎(4)原理：基因重组。‎ ‎(5)受体：表达目的基因。‎ ‎(6)本质：性状在受体体内的表达。‎ ‎(7)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。‎ ‎2．DNA重组技术的基本工具 ‎(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)‎ ‎①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。‎ ‎②作用：识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。‎ ‎③结果：产生黏性末端或平末端。‎ ‎(2)DNA连接酶 ‎①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。‎ ‎②类型 常用类型 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 ‎③DNA连接酶和限制酶的关系 ‎(3)载体 ‎①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。‎ ‎②质粒的特点 易混辨析　载体和膜载体 基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是质粒或动植物病毒等，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的选择透过性有关。‎ ‎1．判断常考语句，澄清易混易错 ‎(1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(　×　)‎ ‎(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(　×　)‎ ‎(3)DNA连接酶能将两碱基间通过形成的氢键连接起来(　×　)‎ ‎(4)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(　×　)‎ ‎(5)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达(　√　)‎ ‎2．分析命题热图，明确答题要点 下图中的图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。请据图回答：‎ ‎(1)EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点分别是什么？‎ 提示　EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在C和G之间。‎ ‎(2)以上实例说明限制酶具有专一性。‎ ‎(3)要将图2中的末端再连接起来，需要T4DNA连接酶。‎ 命题点一　限制性核酸内切酶、DNA连接酶等酶的作用 ‎1．如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，下面选项中能依次表示限制酶、DNA 聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用顺序的是(　　)‎ A．①②③④ B．①②④③‎ C．①④②③ D．①④③②‎ 答案　C 解析　限制酶可在特定位点对DNA分子进行切割；DNA聚合酶在DNA分子复制时将脱氧核苷酸连接成脱氧核苷酸链；DNA连接酶可将限制酶切开的磷酸二酯键连接在一起；解旋酶的作用是将DNA双链解开螺旋，为复制或转录提供模板。‎ ‎2．如图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将目的基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的是(　　)‎ A．HindⅢ B．EcoRⅠ C．EcoB D．PstⅠ 答案　C 解析　A处有BamHⅠ、EcoB、ClaⅠ限制酶的切点，使用A～D中的EcoB切割时，才能让目的基因插入到A处。‎ 与DNA相关的五种酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA (水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 命题点二　载体的作用及特点分析 ‎3．下列关于载体的叙述中，错误的是(　　)‎ A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子 B．对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点 C．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒 D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割 答案　D 解析　载体必须具备的条件有：①对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动；②具有自我复制能力，或能整合到受体细胞的染色体DNA上，随染色体DNA的复制而同步复制；③具有一个至多个限制酶切点，以便目的基因可以插入到载体中；④带有特殊的标记基因，如抗生素抗性基因，以便于对外源基因是否导入进行检测；⑤载体DNA分子大小适合，以便于提取和进行体外操作。‎ ‎4．下面为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题：‎ ‎(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是_____________________________________，‎ 二者还具有其他共同点，如：①__________________，②__________________(写出两条即可)。‎ ‎(2)若质粒DNA分子的切割末端为，则与之连接的目的基因切割末端应为__________________；可使用______________把质粒和目的基因连接在一起。‎ ‎(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为________________，其作用是__________________________________________。‎ ‎(4)下列常在基因工程中用作载体的是(　　)‎ A．苏云金芽孢杆菌抗虫基因 B．土壤农杆菌环状RNA分子 C．大肠杆菌的质粒 D．动物细胞的染色体 答案　(1)DNA　能够自我复制　具有遗传特性 ‎(2)　DNA连接酶 ‎(3)标记基因　供重组DNA的鉴定和选择 ‎(4)C 解析　(1)a代表的物质是拟核DNA分子，质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核之外的小型环状DNA分子，两者都能自我复制，并蕴含遗传信息。(2)质粒DNA分子的切割末端能够与目的基因切割末端发生碱基互补配对，可使用DNA连接酶将它们连接在一起。(3)质粒DNA分子上的氨苄青霉素抗性基因可以作为标记基因，便于对重组DNA进行鉴定和筛选。(4)作为载体必须具备的条件有：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②‎ 有多个限制性核酸内切酶的切点；③有一定的标记基因，便于筛选。常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。苏云金芽孢杆菌抗虫基因一般作为目的基因；土壤农杆菌环状RNA分子不容易在宿主细胞内保存；动物细胞染色体的主要成分是DNA和蛋白质，不能被限制性核酸内切酶切割，因此不能用作载体。‎ 考点二　基因工程的操作过程与应用 ‎1．基因工程的操作过程 ‎(1)目的基因的获取 ‎①从基因文库中获取 基因文库包括：基因组文库和部分基因文库(其中的cDNA文库是利用反转录法获取的)。‎ ‎②利用PCR技术扩增 a．变性(90～95℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链。‎ b．复性(55～60℃)：引物与DNA模板结合，形成局部双链。 ‎ c．延伸(70～75℃)：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的子链。 ‎ d．循环重复上述过程， n次循环后，目的基因的量将被扩增2n倍。‎ ‎③利用化学方法人工合成：基因比较小，核苷酸序列已知时，选择该方法。‎ ‎(2)基因表达载体的构建 ‎①通常用同一种限制酶切割目的基因和质粒，然后用DNA连接酶将二者连接，改造后成为基因表达载体。‎ ‎②组成：目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点。‎ 知识拓展　基因表达载体中启动子、终止子的来源 ‎①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子。在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子，‎ ‎②如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。‎ ‎(3)将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入到Ti Ca2＋处理细胞→‎ 质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 ‎(4)目的基因的检测与鉴定 ‎①分子水平的检测 a．利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无。‎ b．利用分子杂交技术检测目的基因的转录。‎ c．利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因的翻译。‎ ‎②个体生物学水平的鉴定，如抗虫、抗病的接种实验等。‎ ‎2．基因工程的应用 ‎(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。‎ ‎(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质。‎ ‎(3)比较基因治疗与基因诊断 原理 操作过程 进展 基因 治疗 基因表达 利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)‎ 临床 实验 基因 诊断 碱基互补配对 制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况 临床 应用 ‎3.蛋白质工程 ‎(1)流程图 A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。‎ ‎(2)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。‎ ‎(3)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。‎ ‎1．判断常考语句，澄清易混易错 ‎(1)抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达(　√　)‎ ‎(2)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株(　√　)‎ ‎(3)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中(　×　)‎ ‎(4)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达(　×　)‎ ‎(5)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构(　×　)‎ ‎2．分析命题热图，明确答题要点 如图为抗虫棉的培育过程，请据图回答下列问题：‎ ‎(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？‎ 提示　目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。‎ ‎(2)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？‎ 提示　采用的方法是农杆菌转化法，由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了T－DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。‎ ‎(3)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？‎ 提示　抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。‎ 命题点一　基因表达载体构建时限制酶的选择 ‎1．若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是Bgl Ⅱ(A↓GATCT)、EcoR Ⅰ(G↓AATTC)和Sau3A Ⅰ(↓GATC)。下列分析合理的是(　　)‎ A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 答案　D 解析　解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移动方向才一定与图丙相同。‎ ‎2．下图是利用基因工程技术生产可食用疫苗的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列有关说法中正确的是(　　)‎ A．图示过程是基因工程的核心步骤，所需的限制性核酸内切酶均来自原核生物 B．图示中构建基因表达载体时，需要用到一种限制性核酸内切酶 C．一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列 D．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 答案　D 解析　图示表示基因表达载体的构建过程，这是基因工程的核心步骤，所需的限制性核酸内切酶一般来自原核生物，A错误；此表达载体构建时需要用到EcoRⅠ、PstⅠ限制性核酸内切酶，B错误；限制酶具有特异性，即一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列并在特定的位点切割，C错误；抗卡那霉素基因作为标记基因，主要作用是筛选含有目的基因的受体细胞，D正确。‎ 选择限制酶的方法 ‎(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ‎①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。‎ ‎②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。‎ ‎③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。‎ ‎(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 ‎①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。‎ ‎②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。‎ 命题点二　基因工程和蛋白质工程的实例分析 ‎3．下面图1为某植物育种流程，图2表示利用农杆菌转化法获得某种转基因植物的部分操作步骤。下列相关叙述错误的是(　　)‎ A．图1子代Ⅰ与原种保持遗传稳定性，子代Ⅱ和子代Ⅲ选育原理相同 B．图1子代Ⅲ选育显性性状需自交多代，子代Ⅴ可能发生基因突变和染色体变异 C．图2中①过程的完成需要限制酶和DNA连接酶的参与 D．图2中⑥可与多个核糖体结合，并可以同时翻译出多种蛋白质 答案　D 解析　子代Ⅰ是体细胞培养产生的，利用的原理是植物细胞的全能性，属于无性繁殖，所以与原种保持着遗传稳定性；子代Ⅱ为基因工程育种产生的，子代Ⅲ为杂交育种产生的，选育的原理都为基因重组，A正确；子代Ⅲ的选育过程为杂交育种，如果需要显性纯合子，则一定要自交选育多代；子代Ⅴ的选育过程需要用物理因素、化学因素等来处理生物，所以可能发生基因突变和染色体变异，B正确；图2中①过程是构建基因表达载体，其完成需要限制 酶和DNA连接酶的参与，C正确；图2中⑥可与多个核糖体结合，并可以同时翻译出多个同种蛋白质分子，D错误。‎ ‎4．现代生物技术并不是各自独立的，而是相互联系、相互渗透的。下图表示利用乳腺生物反应器生产某种动物蛋白的流程示意图，请分析回答下列问题：‎ ‎(1)该生产流程中应用到的现代生物技术有__________、______________(写出其中两种)。‎ ‎(2)图中A、B分别表示____________________________、______________________。‎ ‎(3)为提高培育成功率，进行②过程之前，对早期胚胎的处理是取其部分细胞用目的基因探针进行__________________检测，对受体动物的处理是用________________进行同期发情处理。‎ ‎(4)蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质，原因是________________________________________________________。‎ 答案　(1)蛋白质工程　基因工程　胚胎移植技术(任写两种)　(2)推测应有的氨基酸序列　基因表达载体 ‎(3)DNA(核酸)分子杂交　促性腺激素　(4)改造后的基因能够遗传(且改造基因易于操作)‎ 解析　(1)由图分析可知，该生产流程中应用到的现代生物技术有蛋白质工程、基因工程、胚胎移植技术等。(2)图中A、B分别表示推测应有的氨基酸序列、基因表达载体。(3)为提高培育成功率，进行②过程之前，对早期胚胎的处理是取其部分细胞用目的基因探针进行DNA分子杂交，对受体动物的处理是用促性腺激素进行同期发情处理。(4)由于改造后的基因能够遗传(且改造基因易于操作)，因此蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质。‎ 蛋白质工程与基因工程的比较 ‎(1)区别 项目 蛋白质工程 基因工程 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列 获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品 结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质 ‎(2)联系 ‎①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。‎ ‎②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。‎ 考点三　DNA的粗提取与鉴定 ‎1．实验原理 ‎(1)DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 溶解规律 ‎2 mol/L ‎ NaCl溶液 ‎0.14 mol/L ‎ NaCl溶液 DNA 溶解 析出 蛋白质 NaCl溶液物质的量浓度从2 mol/L逐渐降低的过程中，溶解度逐渐增大 部分发生盐析沉淀 溶解 ‎(2)DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离。‎ ‎(3)DNA与二苯胺沸水浴加热，呈蓝色。‎ ‎2．操作流程 材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织 ‎↓‎ 破碎细胞(以鸡血为例)：鸡血细胞→加蒸馏水→用玻璃棒 搅拌→用纱布过滤→收集滤液 ‎↓‎ 去除杂质：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质 ‎↓‎ DNA的析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的体积分数为95%的酒精溶液 ‎↓‎ DNA的鉴定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，混合均匀后将试管置于沸水中加热 ‎5 min，溶液变成蓝色 ‎1．判断常考语句，澄清易混易错 ‎(1)进行DNA粗提取和鉴定实验时，加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨(　×　)‎ ‎(2)洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度(　×　)‎ ‎(3)将制备的含有DNA的滤液加入60～75 ℃的恒温水浴箱中保温10～15 min，可以将DNA析出(　×　)‎ ‎(4)本实验可以用哺乳动物的成熟红细胞作为实验材料(　×　)‎ ‎(5)本实验中两次使用蒸馏水的目的不同(　√　)‎ ‎2．分析命题热图，明确答题要点 下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析：‎ ‎(1)操作①和④都是加入蒸馏水，其目的一样吗？‎ 提示　不一样。①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 mol·L－1，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。‎ ‎(2)操作②中加入酒精的目的是什么？此时搅拌要注意什么？‎ 提示　②中加入酒精的目的是析出DNA，去除其中溶于酒精的杂质，这时候搅拌要沿一个方向，轻缓的进行。‎ ‎(3)操作③中的粘稠物是如何获取的？加入2 mol/L NaCl的目的是什么？‎ 提示　粘稠物是经过单层纱布过滤获得的； 加入2 mol/L NaCl的目的是使DNA再次溶解。‎ 命题点　DNA的粗提取与鉴定过程分析 ‎1．在DNA的粗提取实验过程中，对DNA提取量影响较小的是(　　)‎ A．使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，释放出DNA等核物质 B．搅拌时要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动 C．在析出DNA黏稠物时，要缓缓加入蒸馏水，直至黏稠物不再增多 D．要用冷酒精沉淀DNA，甚至可将混合液再放入冰箱中冷却 答案　B 解析　A项的做法是为了充分释放出核中的DNA分子，使进入滤液中的DNA尽量的多；C项是让DNA充分沉淀，保证DNA的量；D项的道理同C项；而B项的操作并不能使DNA增多或减少。‎ ‎2．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：‎ 试管 序号　　‎ A B ‎1‎ 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL ‎2‎ 不加 加入提取的DNA丝状物并搅拌 ‎3‎ 加4 mL二苯胺，混匀 加4 mL二苯胺，混匀 ‎4‎ 沸水浴5分钟 沸水浴5分钟 实验现象 实验结论 ‎(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。‎ ‎(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？‎ ‎________________________________________________________________________‎ ‎________________________________________________________________________。‎ ‎(3)在沸水浴中加热的目的是___________________________________________________‎ ‎________，同时说明DNA对高温有较强的__________。‎ ‎(4)A试管在实验中的作用是__________。‎ ‎(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与________________________________有关。‎ 答案　(1)溶液不变蓝色　溶液逐渐变蓝色　DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色　(2)溶液颜色基本不变　(3)加快颜色反应速度　耐受性　(4)对照　(5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少 解析　A、B两试管形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。‎ DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”‎ 加蒸馏 水2次 ‎①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出 用纱布 过滤4次 ‎①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 mol/L的NaCl充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液 用NaCl 溶液4次 ‎①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA ‎ [构建知识网络]‎ ‎[必背答题语句]‎ ‎1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割 DNA分子。DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。‎ ‎2．质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。‎ ‎3．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。‎ ‎4．培育转基因动物时，受体细胞必须是受精卵，培育转基因植物时的受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。‎ ‎5．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。‎ ‎6．目的基因到了另一种生物体内能够成功表达的原理是所有生物共用一套遗传密码。‎ 重温高考　演练模拟 ‎1．(2015·重庆，6)下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是(　　)‎ A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得 B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点 C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来 D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用 答案　C 解析　人肝细胞不能合成胰岛素，则人肝细胞中不含有胰岛素的mRNA，不能通过反转录获得人胰岛素基因，A错误；表达载体的复制启动于复制起点，胰岛素基因的表达启动于启动子，B错误；抗生素抗性基因是标记基因，可用于筛选含胰岛素基因的受体细胞，C正确；启动子在转录过程中起作用，终止密码子在翻译过程中起作用，D错误。‎ ‎2．图1、2分别为“DNA的粗提取与鉴定”实验中部分操作步骤示意图，下列叙述不正确的是(　　)‎ A．图1、2中加入蒸馏水稀释的目的相同 B．图1中完成过滤之后保留滤液 C．图2中完成过滤之后弃去滤液 D．在图1鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉有助于去除杂质 答案　A 解析　A项错，图1、2 中加入蒸馏水稀释的目的分别是破碎细胞获取含DNA的滤液；稀释NaCl溶液，析出DNA；B项对，图1 过滤之后保留滤液，因滤液中含DNA；C项对，图2过滤之后弃去滤液，因DNA已析出；D项对，嫩肉粉中的蛋白酶可对蛋白质进行水解。‎ ‎3．(2016·全国乙，40)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：‎ ‎(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。‎ ‎(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是___________________________________‎ ‎________________________________________________________________________；‎ 并且________________和____________________________________的细胞也是不能区分的，其原因是________________________________________________________________________‎ ‎________________________________________________________________________。‎ 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有________的固体培养基。‎ ‎(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________________________________________________________________________。‎ 答案　(1)能自我复制、具有标记基因 ‎(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素 ‎(3)受体细胞 解析　(1)作为载体必须具备如下特点：①能自我复制，从而在受体细胞中稳定保存；②含标记基因，以供重组DNA的鉴定和选择；③具一个至多个限制性核酸内切酶切割位点以便外源DNA片段插入。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，故不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr，因而能在培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞完成DNA复制。‎ ‎4．(2016·天津，7)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。‎ ‎(1)为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。‎ ‎(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是________(填写字母，单选)。‎ A．人血细胞启动子 B．水稻胚乳细胞启动子 C．大肠杆菌启动子 D．农杆菌启动子 ‎(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是________________________________________________________________________。‎ ‎(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是________________________________________‎ ‎________________________________________________________________________。‎ ‎(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与________的生物学功能一致。‎ 答案　(1)总RNA(或mRNA)‎ ‎(2)B　(3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化　(4)水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工　(5)HSA 解析　(1)总cDNA是由细胞内mRNA经逆转录获得。DNA 两条链是反向平行的，另一条引物扩增方向应向左。(2)据题意可知，启动子具有物种特异性，它应与受体细胞启动子一致，应选B。(3)在农杆菌转化时，加入某物质，其目的应为“促进”或“有利于”转化，推测酚类物质可吸引农杆菌侵染水稻受体细胞。(4)水稻是真核细胞，具有对分泌蛋白加工的内质网和高尔基体。Ⅱ途径受体为大肠杆菌，没有上述细胞器。(5)制备的rHSA应具有与HSA相同的生物学功能才具有医用价值。‎ ‎1．限制性核酸内切酶Mun Ⅰ和限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是(　　)‎ 答案　A 解析　由图可知，质粒B上无标记基因，不适合作为载体；质粒C和D的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点。只有质粒A上既有标记基因，且Mun Ⅰ的切割点不在标记基因上。‎ ‎2．(2015·北京，5)在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是(　　)‎ A．用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞 B．用选择培养基筛选导入目的基因的细胞 C．用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生质体融合 D．用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽 答案　C 解析　农杆菌侵染细菌是基因工程中常用到的，把目的基因导入植物细胞的方法，A正确；目的基因是否导入了细胞，需要在选择培养基上进行筛选，B正确；在植物细胞组织培养的过程中，需要调整培养基中生长素和细胞分裂素的比例，来达到对其脱分化和再分化的控制，D正确；在农杆菌侵染植物细胞的过程中，并没有涉及到原生质体的融合，所以C错误。‎ ‎3．下面为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是(　　)‎ A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与 B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状 D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异 答案　D 解析　构建重组质粒需要用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶，不需要DNA聚合酶；含重组Ti质粒的农杆菌侵染植物细胞后，重组Ti质粒的T－DNA整合到受体细胞的染色体上，而不是重组Ti质粒整合到受体细胞的染色体上；导入受体细胞的目的基因表达后，转基因植株方能表现出相应性状，若目的基因在受体细胞中不表达，转基因植株不能表现出相应性状；⑤表现出抗虫性状则表明该植株细胞发生了基因重组，基因重组是可遗传变异。‎ ‎4．抗菌肽对治疗癌症有一定的作用，下图表示抗菌肽合成过程。相关说法正确的是(　　)‎ A．用PCR克隆目的基因不需要DNA解旋酶 B．基因表达载体包含起始密码和终止密码 C．用显微注射法导入基因表达载体 D．筛选菌种时用基因探针检测相关蛋白质 答案　A 解析　PCR技术中采用的是高温变性，因此用PCR克隆目的基因不需要DNA解旋酶，A正确；基因表达载体包含启动子和终止子，而起始密码和终止密码在mRNA上，B错误；将基因表达载体导入酵母菌细胞时应用感受态细胞法，C错误；筛选菌种时用基因探针检测相关基因或mRNA，不能用基因探针检测蛋白质，D错误。‎ ‎5．下列关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)‎ A．酵母和菜花均可作为提取DNA的材料 B．DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水 C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物 D．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝 答案　C 解析　A项，原则上含DNA的生物材料都可作为提取DNA的材料，只是DNA含量高的材料成功的可能性更大。B项，DNA在2 mol/L的NaCl溶液和蒸馏水中溶解度都较大。C项，向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞会吸水破裂，玻棒搅拌会加快血细胞的破裂，但在 蒸馏水中不会析出DNA。D项，DNA溶液加入二苯胺试剂后需沸水浴加热，待冷却后变蓝色。‎ ‎6．样品DNA在经PCR技术扩增后，可以获取大量DNA分子克隆。在试管中进行DNA的人工复制(如图)。在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需的遗传物质不再受限于活动的生物体。据图回答下列问题：‎ ‎(1)PCR技术的原理是__________________________________________________，‎ 图中A过程表示________________。‎ ‎(2)某样品DNA中共含3 000个碱基对，碱基数量满足：(A＋T)∶(G＋C)＝1/2，现欲得到100个与样品相同的DNA，至少需要向试管中加入________个腺嘌呤脱氧核苷酸。‎ ‎(3)A过程也称为DNA的变性，此过程在温度高达90～95 ℃时才能完成，说明DNA分子具有________性。利用PCR技术获取目的基因的前提是__________________________。‎ ‎(4)由图中信息分析可知，催化C过程的酶是______________，它与正常细胞里的酶的区别是________________。‎ 答案　(1)DNA分子的半保留复制　DNA解旋 ‎(2)99 000‎ ‎(3)稳定　要有一段已知目的基因的核苷酸序列 ‎(4)DNA聚合酶　能耐高温 解析　PCR技术是穆里斯等人在1988年发明的，它是利用DNA双链半保留复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数形式增加。其前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。扩增的过程是目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在耐高温的DNA聚合酶的作用下进行延伸，如此重复循环结合，使目的基因呈指数形式扩增。‎ ‎7．(2016·海南，31)基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：‎ ‎(1)在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即____________和从____________中分离。‎ ‎(2)利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是________________________________‎ ‎________________________________________________________________________。‎ ‎(3)在基因表达载体中，启动子是________聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是____________。‎ ‎(4)将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有________和________颗粒。‎ 答案　(1)人工合成　生物材料 ‎(2)cDNA文库中只含有叶细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因 ‎(3)RNA　大肠杆菌(或细菌)‎ ‎(4)金粉　钨粉 解析　(1)获取目的基因主要有两大途径，即人工合成和从自然界已有的物种中分离。‎ ‎(2)在植物的成熟叶片中基因选择性表达，因此由所有RNA逆转录形成的cDNA文库中只含有叶细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因。‎ ‎(3)在基因表达载体中，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，由于易于培养，最常选用大肠杆菌(或细菌)。‎ ‎(4)将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有金粉和钨粉。‎ ‎8．(2016·全国丙，40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。‎ 根据基因工程的有关知识，回答下列问题：‎ ‎(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是________________________________________________________________________‎ ‎________________________________________________________________________。‎ ‎(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________________，不能表达的原因是___________________________________________________________。‎ ‎(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有______________和 ‎______________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________________________。‎ 答案　(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲、丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录　(3)E·coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶 解析　(1)由于限制性核酸内切酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割后形成的黏性末端相同，所以经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。图中甲、丙均不符合，所以不能表达目的基因的产物。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。‎ ‎9．将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如下图所示：‎ 注：农杆菌中Ti质粒上只有TDNA片段能转移到植物细胞中。‎ ‎(1)过程①需用同种__________________酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。为将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用________培养基。‎ ‎(2)过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让________进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是_______________________‎ ‎________________________________________________________________________。‎ ‎(3)若过程④仅获得大量的根，则应在培养基中增加__________________以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是______________________________________‎ ‎________________________________________________________________________。‎ ‎(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用的方法是__________________。种植转基因抗虫棉能减少________的使用，以减轻环境污染。‎ 答案　(1)限制性核酸内切(限制)　选择　(2)TDNA　筛选出获得TDNA片段的植物细胞　(3)细胞分裂素浓度　芽顶端合成的生长素向基部运输，促进根的分化 ‎(4)投放棉铃虫　农药 解析　(1)构建重组DNA分子的过程需要用同一种限制性核酸内切酶(限制酶)切割目的基因和质粒，以便产生相同的黏性末端。只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基叫做选择培养基，这里只允许含重组质粒的农杆菌生长，应使用选择培养基。(2)过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让重组质粒中的TDNA 片段进入棉花细胞，除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是筛选出含目的基因的受体细胞。(3)生长素可诱导根的形成，细胞分裂素可诱导芽的形成。在没有激素的培养基上的芽也长出了根，可能与芽自身合成生长素并向下运输促进根的形成有关。(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是直接投放害虫，观察其生存情况。种植转基因抗虫棉能减少农药的使用，以减轻环境污染。‎ ‎10．下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。‎ ‎(1)图中实验材料A可以是________等，研磨前加入的B应该是__________________。‎ ‎(2)通过上述所示步骤得到滤液C后， 再向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是________________，再过滤得到滤液D，向滤液D中加入蒸馏水的目的是________________________。‎ ‎(3)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得下表所示的4种滤液，含DNA最少的是滤液________。‎ ‎1‎ 研磨液中 搅拌研磨 后过滤 滤液E ‎2‎ ‎2 mol/L的NaCl溶液中 搅拌后过滤 滤液F ‎3‎ ‎0.14 mol/L的NaCl溶液中 搅拌后过滤 滤液G ‎4‎ 冷却的95%的酒精溶液中 搅拌后过滤 滤液H ‎(4)DNA鉴定的原理是____________________________________________________________‎ ‎________________________________________________________________________。‎ 答案　(1)洋葱(菜花等)　洗涤剂和食盐　(2)使DNA溶解　使DNA(溶解度下降而沉淀)析出　(3)H ‎(4)在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色 解析　选用洋葱、菜花等植物材料提取DNA时，要在切碎的材料中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨；DNA在2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高，而在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最小。向滤液中加入2 mol/L 的NaCl溶液可以使DNA溶解，过滤除去不溶的杂质。向滤液中加入蒸馏水可降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出，除去溶解在低盐溶液中的杂质；DNA不溶于冷酒精，可利用这一原理进一步提纯DNA；鉴定DNA 的原理是在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。‎