高中生物第4章基因工程第1节基因工程的基本原理和技术同步备课教学案北师大版选修3 17页

第 1 节 基因工程的基本原理和技术 [目标导读] 1.阅读教材 P66～67 内容，阐明基因工程的概念、特点及理论基础。2.结合教材 P68 图 4－4、P69 图 4－5，理解 DNA 分子的切割技术和连接技术。3.分析教材 P70～71 图文，认 识 DNA 分子的运输工具——运载体。 [重难点击] 1.基因工程的概念、特点及理论基础。分子的切割技术、连接技术及运载工具。 科学设想：能否让禾本科植物也能固定空气中的氮？能否让细菌“吐出”蚕丝？能否让微生 物产生人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？经过多年努力，科学家于 20 世纪 70 年代创立了 可以定向改造生物的新技术——基因工程。这一技术是在 DNA 分子水平上进行的，在微小的 DNA 分子上进行的操作，需要专用的工具。这些工具是什么？各自的作用是什么？让我们一 起来了解一下吧！ 解决学生疑难点 一、基因工程的概述 1．基因工程的概念 基因工程也叫 DNA 重组技术，它是在分子水平上进行的一种外科手术式的遗传操作，借助于 实验室的技术，将某种生物的基因或基因组提取出来，在生物体外进行加工改造或重新组合， 再转移到另一种生物中去，从而定向地改变生物的遗传特性，创造出新型的生物。 2．基因工程研究的理论基础 理论基础 操作技术 DNA 是主要的遗传物质，是生物大分子 提取 DNA 和对 DNA 分子在体外进行遗传操作 DNA 进行半保留复制 异源 DNA 片段连接后可在体内或者体外扩增 “中心法则”和操纵子学说、遗传密码 的通用性 不同生物间基因转移和表达 根据基因工程的基本原理分析回答： 1．有性生殖中的基因重组是随机的，且只能在同一物种间进行。基因工程操作导致的基因 重组与前述基因重组有何区别？ 答案 基因工程可以在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。 2．分析不同生物的 DNA 分子能拼接起来的原因。 答案 基本组成单位相同：都是四种脱氧核糖核苷酸；双链 DNA 分子的空间结构相同：都是 规则的双螺旋结构。 3．外源基因能够在受体内表达，并使受体表现出相应的性状的原因是什么？ 答案 生物界共用一套遗传密码，相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质。 1．目前，科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子 的血红蛋白。下列不是这一先进技术的理论依据的是( ) A．所有生物共用一套遗传密码 B．基因能控制蛋白质的合成 C．兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的 DNA 都是由四种脱氧核糖核苷酸构成的，都遵循相同的 碱基互补配对原则 D．兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先 答案 D 解析 题干表述的是目的基因导入受体细胞并得以表达的过程，目的基因在不同生物细胞中 能够表达出相同的 蛋白质，说明控制其合成的信使 RNA 上的密码子是共用的，相同的密码子决定相同的氨基酸， A 正确；基因通过转录出信使 RNA，进而控制蛋白质的合成，B 正确；基因是有遗传效应的 DNA 片段，只要是双链 DNA 都遵循碱基互补配对原则，其组成原料都是四种脱氧核糖核苷酸， C 正确；生物之间是否有共同的原始祖先与转基因技术之间没有必然关系，D 错误。 二、DNA 分子的切割技术和连接技术 1．DNA 分子的切割技术 (1)工具：限制性内切酶(限制酶)。 (2)来源：主要存在于微生物中。 (3)限制性内切酶的功能特点 ①会识别 DNA 上某种核苷酸的特定序列和位置。 ②在特定序列中的特定位点将 DNA 切开。 (4)实例：限制性内切酶 EcoRⅠ ①只能识别 GAATTC 序列的位点，并且在 G 和 A 之间将这段 DNA 序列切开。 ②切开的 DNA 两条单链的切口之间正好互补配对，这样的切口叫做黏性末端。 2．DNA 分子的连接技术 (1)工具：DNA 连接酶。 (2)作用 ①用同一种限制酶分别把两种不同来源的 DNA 切成片段，混合后它们就会通过黏性末端互相 识别，自动靠拢，进行碱基配对。 ②黏性末端与末端之间留有的空隙则靠 DNA 连接酶进行“缝合”，如图。 小贴士 限制性内切酶的作用是切割识别特定的核苷酸序列的两个核苷酸之间的磷酸二酯 键。DNA 连接酶的作用是催化两条 DNA 链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核苷 酸连接起来，而不是连接互补碱基之间的氢键。 下图为 DNA 分子的切割和连接过程，请据图分析： 1．限制性内切酶 EcoRⅠ的识别序列和切割位点分别是什么？ 答案 EcoRⅠ的识别序列为 GAATTC，切割位点是在 G 和 A 之间。 2．由图可知 DNA 连接酶的作用部位是“①”还是“②”，形成了什么化学键？ 答案 DNA 连接酶的作用部位为①，形成了磷酸二酯键。 3．DNA 连接酶和 DNA 聚合酶均能形成磷酸二酯键，二者的作用对象相同吗？为什么？ 答案 不相同。DNA 连接酶是将两个 DNA 片段连接起来，而 DNA 聚合酶是将单个的脱氧核糖 核苷酸加到已有的 DNA 片段上。 2．下表为常用的限制性内切酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中， 正确的是( ) 限制性内切酶 识别序列和切割位点 限制性内切酶 识别序列和切割位点 BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C EcoRⅠ G↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG 注：Y 表示 C 或 T，R 表示 A 或 G。 A．一种限制酶只能识别一种核苷酸序列 B．限制酶切割后一定形成黏性末端 C．不同的限制酶可以形成相同的黏性末端 D．限制酶的切割位点在识别序列内部 答案 C 解析 根据表格内容可以推知，每种限制酶都能识别特定的核苷酸序列，但不一定只能识别 一种序列，如限制酶 HindⅡ，A 项错误；限制酶切割后能形成黏性末端或平末端，如限制酶 HindⅡ切割后露出平末端，B 项错误；不同的限制酶切割后可能形成相同的黏性末端，如限 制酶 BamHⅠ和 Sau3AⅠ切割后露出的黏性末端相同，C 项正确；限制酶的切割位点可以位于 识别序列的外侧，如 Sau3AⅠ，D 项错误。 题后归纳 (1)DNA 连接酶与 DNA 聚合酶的比较 比较项目 DNA 连接酶 DNA 聚合酶 相同点 催化两个脱氧核糖核苷酸之间形成磷酸二酯键 不 同 点 模板 不需要模板 需要 DNA 的一条链为模板 作用 过程 在两个 DNA 片段之间形成磷 酸二酯键 将单个核苷酸加到已存在的核酸片段 的 3′端的羟基上，形成磷酸二酯键 对象 游离的 DNA 片段 单个的脱氧核糖核苷酸 作用 结果 形成完整的 DNA 分子 形成 DNA 的一条链 用途 基因工程 DNA 复制 (2)四种酶的作用部位 限制性内切酶、DNA 连接酶、DNA 聚合酶作用于①部位，DNA 解旋酶作用于②部位。 三、DNA 分子的运载工具 1．作为运载体的条件 (1)能够比较自由地进出细胞，并能在细胞内自我复制。 (2)能使带进去的 DNA 在细胞里面进行复制，并且保持原有特性。 (3)具有某些简单的特性，如抗药性、免疫性等，供重组 DNA 的鉴定和选择。 2．运载体的种类 质粒、噬菌体、动植物病毒，最理想的运载体是质粒。 3．质粒 (1)来源：细菌等生物。 (2)本质：细菌染色体外的一种很小的环状 DNA 分子。 (3)特点：能够自我复制，带有某些抗性基因(报告基因)，能够在细胞间钻进穿出。 小贴士 质粒上还应具有一个或者多个限制性内切酶的识别序列和切割位点，以便连接上外 源 DNA，天然的质粒很难具有上述的所有条件，因此基因工程中使用的质粒往往是人为加工 过的。 下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图探究以下问题： 1．a 代表的物质和质粒都能进行自我复制，它们的化学本质是什么？ 答案 化学本质都是 DNA。 2．某目的基因切割末端为－A －TGCGC ，为使质粒和目的基因连接在一起，质粒应有的一段核 苷酸序列及被限制性内切酶切割的末端分别是什么？ 答案 －ACGCGT－ CGCGT－ －TGCGCA－； A－。 3．氨苄青霉素抗性基因能控制某物质的合成，该物质能抵抗氨苄青霉素，使含有该基因的 生物能在含氨苄青霉素的环境中存活。因此，氨苄青霉素抗性基因在基因工程载体上能起什 么作用？ 答案 用作标记基因，供重组 DNA 的鉴定与选择。 3．质粒之所以能做基因工程的载体，是由于它( ) A．含蛋白质，从而能完成生命活动 B．能够自我复制，且能保持连续性 C．含 RNA，能够指导蛋白质的合成 D．具有环状结构，能够携带目的基因 答案 B 解析 质粒存在于细菌和酵母菌等生物中，是一种很小的环状 DNA 分子，其上有报告基因， 便于检测。质粒在受体细胞中，能随受体细胞 DNA 的复制而复制，进行目的基因的扩增和表 达。 4．质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。某细菌质粒上有标记基因如 图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不 同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有 a、b、c)， 请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组细菌的外源基因插入点，正确的一组 是( ) 细菌在含氨苄青霉素的培 养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况 ① 能生长 能生长 ② 能生长 不能生长 ③ 不能生长 能生长 A．①是 c；②是 b；③是 a B．①是 a 和 b；②是 a；③是 b C．①是 a 和 b；②是 b；③是 a D．①是 c；②是 a；③是 b 答案 A 解析 ①细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因和抗四环 素基因都没有被破坏，所以插入点是 c。②细菌不能在含四环素的培养基上生长，说明其抗 四环素基因被破坏，插入点为 b。③细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，说明其抗氨 苄青霉素基因被破坏，故插入点为 a。 拓展提升 标记基因的筛选原理 (1)前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没 有抵抗相关抗生素的能力。 (2)过程：将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受 体细胞对该抗生素产生抗性，然后在培养基中加入该抗生素。 (3)结果：在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的是具有抗性的 受体细胞，含有目的基因的细胞得以筛选。 1．以下有关基因工程的叙述，正确的是( ) A．基因工程是细胞水平上的生物工程 B．基因工程的产物对人类都是有益的 C．基因工程产生的变异属于基因突变 D．基因工程育种的优点之一是目的性强 答案 D 解析 基因工程是对基因(分子结构)的操作而非细胞水平的操作；基因工程可以创造出符合 人们要求的新产品，但并非一定是对人类有益的；基因工程产生的变异属于基因重组而不是 基因突变；基因工程育种是按照人们的需要进行的，因而目的性强。 2．下列黏性末端可能由同一种限制酶切割而成的是( ) A．①② B．①③ C．①④ D．②③ 答案 B 解析 只有①和③两个黏性末端的碱基是互补的，可能是由同一种限制酶切开形成的。 3．DNA 连接酶的重要功能是( ) A．DNA 复制时催化母链与子链之间形成氢键 B．连接黏性末端的碱基之间的化学键 C．将两条 DNA 片段末端之间的缝隙连接起来 D．催化 DNA 片段与单个核苷酸之间形成磷酸二酯键 答案 C 解析 DNA 连接酶的作用只是催化 DNA 片段的“缝合”，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸 之间的磷酸二酯键；它不能催化氢键的形成，也不能使已有的 DNA 片段与单个核苷酸之间形 成磷酸二酯键。 4．作为基因的运输工具——基因的运载体，必须具备的条件之一及理由是( ) A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因 B．具有一个至多个限制酶切点，以便于目的基因的表达 C．具有某些报告基因，以便为目的基因的表达提供条件 D．能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选 答案 A 解析 作为运载体要携带目的基因进入受体细胞并使之表达，必须能够在宿主细胞内稳定地 保存并大量复制，以便通过复制提供大量的目的基因。同时要具有某些报告基因，是为了通 过报告基因是否表达来判断目的基因是否进入了受体细胞，从而对受体细胞进行筛选。运载 体要具有一个至多个限制酶切点，则是为了便于与外源基因连接。 5．通过 DNA 重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。科学家运用这一技术使 羊奶中含有人体蛋白质，下图表示了这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因“剪刀” 能识别的序列和切点是—G↓GATCC—，请回答下列问题。 (1)从羊染色体中“剪下”羊蛋白质基因的酶是______________。人的蛋白质基因“插入” 后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是________________。 (2)请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。 —G↓GATCC— ―→ (3)人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，原因是______________，“插入” 时用的工具是__________，其种类有______________________。 答案 (1)限制酶(限制性内切酶) DNA 连接酶 (2) (3)基因的组成、碱基配对方式和空间结构是相同的 运载体 质粒、动植物病毒、噬菌体 等 解析 基因工程所用的工具酶是限制酶(限制性内切酶)和 DNA 连接酶，不同生物的基因之所 以能整合在一起，是因为基因的组成、碱基配对方式和空间结构是相同的。将目的基因导入 受体细胞，离不开运载体的协助，基因工程中常用的运载体除质粒外，还有动植物病毒、噬 菌体等。 课时作业 [基础过关] 1．实施基因工程的最终目的是( ) A．提取生物体的 DNA 分子 B．对 DNA 分子进行人工剪切 C．在生物体外对 DNA 分子进行改造 D．创造符合人们需要的新生物类型和生物产品 答案 D 解析 A、B 和 C 三项均为基因工程操作的具体内容，但不是基因工程的目的。实施基因工 程的最终目的是通过基因操作定向改造生物的遗传物质，创造符合人们需要的新的生物类型 和生物产品。 2．如图所示是限制性内切酶切割某 DNA 分子的过程，从图中可知，该限制性内切酶能识别 的核苷酸序列及切点是( ) A．CTTAAG，切点在 C 和 T 之间 B．CTTAAG，切点在 G 和 A 之间 C．GAATTC，切点在 G 和 A 之间 D．GAATTC，切点在 C 和 T 之间 答案 C 解析 由题意知，该限制性内切酶能识别的核苷酸序列是 GAATTC，专一切口是 G 和 A 之间。 3．下列关于限制性内切酶的叙述，错误的是( ) A．限制性内切酶可从原核生物中提取 B．同一种限制性内切酶切割不同的 DNA 分子产生的末端能够进行碱基互补配对 C．限制性内切酶能任意切割 DNA 分子，从而产生大量的 DNA 片段 D．每一种限制性内切酶只能识别特定的核苷酸序列 答案 C 解析 限制性内切酶存在于许多原核生物中，可以从中提取；每种限制性内切酶只能识别特 定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割 DNA 分子；同一种限制性内切酶切割不同的 DNA 产生的末端能够进行碱基互补配对。 4．下列关于限制性内切酶和 DNA 连接酶的说法中，正确的是( ) A．其化学本质都是蛋白质 B．DNA 连接酶可恢复 DNA 分子中的氢键 C．在基因工程中 DNA 聚合酶可以替代 DNA 连接酶 D．限制性内切酶切割后一定能产生黏性末端 答案 A 解析 限制性内切酶和 DNA 连接酶的化学本质都是蛋白质。 5．作为运载体的质粒不可能具有( ) A．一个至多个限制性内切酶的切割位点 B．特殊的遗传报告基因 C．经人工改造的特点 D．复杂的结构 答案 D 解析 质粒是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核 DNA 之外的，并具有自我复制能力 的双链环状 DNA 分子。 6．下列有关细菌质粒的叙述，正确的是( ) A．质粒是存在于细菌细胞中的一种颗粒状的细胞器 B．质粒是细菌细胞中能自主复制的小型环状 DNA 分子 C．质粒只有在侵入宿主细胞后在宿主细胞内复制 D．细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行 答案 B 解析 质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状 DNA 分子，可以在细菌细胞内或宿主细胞 内复制。 [能力提升] 7．下图为 DNA 分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切酶、DNA 聚 合酶、DNA 连接酶、解旋酶作用顺序的是( ) A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③② 答案 C 解析 图示中①表示该酶切割 DNA 分子双链产生黏性末端的过程，用到的酶是限制性内切 酶；②是黏性末端连接的过程，用到的酶是 DNA 连接酶；③是 DNA 分子解旋的过程，要用解 旋酶；④是 DNA 复制过程，需要 DNA 聚合酶。 8．据图所示，有关工具酶功能的叙述错误的是( ) A．限制性内切酶可以切断 a 处 B．DNA 聚合酶可以连接 a 处 C．解旋酶可以使 b 处解开 D．DNA 连接酶可以连接 c 处 答案 D 解析 DNA 连接酶连接的是两个相邻的脱氧核糖核苷酸的磷酸和脱氧核糖，形成磷酸二酯 键，如 a 处，而图示中的 c 处连接的是同一个脱氧核糖核苷酸的磷酸和脱氧核糖。 9．下列说法中不正确的有( ) ①限制性内切酶主要是从真核生物中分离纯化出来的 ②DNA 连接酶都是从原核生物中分 离得到的 ③所有限制性内切酶识别的核苷酸序列均由 6 个核苷酸组成 ④不同限制性内 切酶切割 DNA 的位点不同 ⑤有的质粒是单链 DNA A．①②④⑤ B．①②③⑤ C．②③④⑤ D．①③④⑤ 答案 B 解析 限制性内切酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，有很少量是来自真核生物——酵 母菌，①错误；T4DNA 连接酶来源于 T4 噬菌体(一种病毒)，②错误；EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ限制 性内切酶识别的序列均为 6 个核苷酸，也有少数限制性内切酶的识别序列由 4、5 或 8 个核 苷酸组成，③错误；不同限制性内切酶切割 DNA 的位点不同，切割出不同的黏性末端或平末 端，④正确；所有的质粒都是双链的环状 DNA 分子，⑤错误。故选 B。 10．下面是四种不同质粒的示意图，其中 ori 为复制必需的序列，Ampr 为氨苄青霉素抗性基 因，Tetr 为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性内切酶的酶切位点。若要得到一个能在四 环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组 DNA 的细胞，应选用的质粒是 ( ) 答案 C 解析 A 项破坏了复制必需的序列。B 项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，在 四环素培养基上和氨苄青霉素培养基上都能生长。C 项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素 抗性基因完好，能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长。D 项氨苄青霉 素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏，能在氨苄青霉素培养基上生长而不能在四环素培 养基上生长。 11．如图表示两种限制性内切酶识别 DNA 分子特定序列，并在特定位点对 DNA 进行切割的示 意图，请回答以下问题： 甲： 5′—T—C—G—A—A—T—T—C— 3′—A—G—C—T—T—A—A—G— ↓EcoR Ⅰ —T—C—G— —A—A—T—T—C— —A—G—C—T—T—A—A— —G— 乙： 5′—G—T—T—A—A—C— 3′—C—A—A—T—T—G— ↓Hpa Ⅰ —G—T—T— —A—A—C— —C—A—A— —T—T—G— (1)图中甲和乙代表__________________________________________。 (2)EcoRⅠ、HpaⅠ代表__________________________。 (3)图中甲经过相应操作形成两个片段，切口的类型为______________。 (4)由图解可以看出，限制性内切酶的作用特点是_______________________________。 答案 (1)有特定脱氧核糖核苷酸序列的 DNA 片段 (2)两种不同的限制酶 (3)黏性末端 (4)每种限制性内切酶都能识别特定的脱氧核糖核苷酸序列并从特定的位点将 DNA 分子切开 解析 图中甲和乙代表有特定脱氧核糖核苷酸序列的 DNA 片段，EcoRⅠ、HpaⅠ代表两种不 同的限制性内切酶。由图可知，EcoRⅠ的切点是 G、A，甲经 EcoRⅠ处理后形成两个黏性末 端；HpaⅠ的切点是 T、A，乙经 HpaⅠ处理后形成的是平末端。由此可见，限制性内切酶的 作用特点是：能识别双链 DNA 分子的特定脱氧核糖核苷酸序列，并从特定的位点将 DNA 分子 切开。 12．基因工程中，需要使用限制性内切酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制 性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是 —↓GATC—。 (1)根据已知条件和图回答下列问题： ①上述质粒用限制性内切酶________切割，目的基因用限制性内切酶________切割。 ②将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，还要加入适量的____________。 ③请指出质粒上至少要有一个报告基因的理由：_____________________________ ________________________________________________________________________。 (2)不同生物的基因可以拼接的结构基础是_________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)大肠杆菌是首先成功表达外源基因的宿主菌，但不能表达结构复杂的蛋白质，哺乳类细 胞、昆虫细胞表达系统虽然能表达结构复杂的哺乳类细胞蛋白，但操作复杂，表达水平低， 不宜推广使用。基因工程中常选用酵母菌作为受体细胞，请从细胞结构等方面分析用酵母菌 作为受体细胞能克服上述不足的理由：_________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案 (1)①Ⅰ Ⅱ ②DNA 连接酶 ③检测重组质粒(或目的基因)是否导入受体细胞 (2)DNA 结构基本相同(其他合理答案均可) (3)①单细胞真核生物，含有加工、修饰蛋白质 的内质网和高尔基体；②繁殖速度快，能很快得到大量的目的基因；③培养成本低；④容易 培养 13．下表中列出了几种限制性内切酶识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中箭头表示相关限 制性内切酶的酶切位点。请回答下列问题： 限制性内切酶 BamHⅠ HindⅢ EcoRⅠ SmaⅠ 识别序列及切割 位点 G↓GATCC CCTAG↑G A↓AGCTT TTCGA↑A G↓AATTC CTTAA↑G CCC↓GGG GGG↑CCC (1)一个图 1 所示的质粒分子经 SmaⅠ切割前后，分别含有__________个游离的磷酸基团。 (2)若对图中质粒进行改造，插入的 SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越__________。 (3) 用 图 中 的 质 粒 和 外 源 DNA 构 建 重 组 质 粒 ， 不 能 使 用 SmaⅠ 切 割 ， 原 因 是 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)与只使用 EcoRⅠ相比较，使用 BamHⅠ和 Hind Ⅲ两种限制性内切酶同时处理质粒、外源 DNA 的优点在于可以防止____________________________________________。 (5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入____________酶。 (6)现使用 BamHⅠ和 HindⅢ两种限制性内切酶同时处理质粒、外源 DNA，并经拼接获得的重 组质粒进行再次酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图 1、2 中标示的酶 切位点及表所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。 ①采用 BamHⅠ和 HindⅢ酶切，得到________种 DNA 片段。 ②采用 EcoRⅠ和 HindⅢ酶切，得到________种 DNA 片段。 答案 (1)0、2 (2)高 (3)SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源 DNA 中的目的基因 (4)质 粒和含目的基因的外源 DNA 片段自身环化 (5)DNA 连接 (6)①2 ②3 解析 (1)该质粒为环状 DNA 分子，经 SmaⅠ切割前，不含有游离的磷酸基团，经 SmaⅠ切割 后含有 2 个游离的磷酸基团。 (2)SmaⅠ识别的是 CCCGGG 序列，在 C 与 G 之间切割，SmaⅠ酶切位点越多，也就是 C—G 碱 基对越多，由于 C 与 G 之间的氢键(3 个)比 A 与 T 之间的氢键(2 个)数量多，故其含量越多， 质粒的热稳定性越高。 (3)据图 1 可知，SmaⅠ切割位点在抗生素抗性基因(报告基因)中，据图 2 可知，SmaⅠ切割 位点在目的基因中，因此使用 SmaⅠ切割会破坏质粒的抗性基因、外源 DNA 中的目的基因。 (4)用同一种限制性内切酶处理质粒和外源 DNA，再用 DNA 连接酶连接时，往往会有三种连 接形式：目的基因—质粒、目的基因—目的基因(环化)、质粒—质粒(环化)，后两种是我们 不需要的，因而要进行筛选。用两种限制酶处理质粒和外源 DNA，因形成的末端不同可避免 上述情况的发生。 (5)连接质粒与目的基因的工具酶是 DNA 连接酶。 (6)由 BamHⅠ和 HindⅢ两种限制性内切酶同时处理质粒、外源 DNA，并经拼接获得的重组质 粒，这两种酶的识别序列仍然完整存在，如再用 BamHⅠ和 HindⅢ两种限制性内切酶进行酶 切时，可再度被切开，形成 2 种 DNA 片段；而 EcoRⅠ的识别序列在原质粒中存在并没有破 坏，同时切下的目的基因中还存在 1 个 EcoRⅠ的识别序列，因此在重组质粒中存在 2 个 EcoRⅠ的识别序列，如用 EcoR Ⅰ和 Hind Ⅲ酶切，可得到 3 种 DNA 片段。 [真题体验] 14．(2016·全国乙，40)某一质粒载体如图所示，外源 DNA 插入到 Ampr 或 Tetr 中会导致相 应的基因失活(Ampr 表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr 表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载 体用 BamHⅠ酶切后，与用 BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入 DNA 连接酶进行连接反应， 用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大 肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒 的大肠杆菌。请回答下列问题： (1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有___________________(答出两点即 可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。 (2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和 仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_____________________________；并且 ________________ 和 ________________________ 的 细 胞 也 是 不 能 区 分 的 ， 其 原 因 是 ________________________________________________________________________。在上述 筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含 有________的固体培养基。 (3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为运载体，其 DNA 复制所需的原料来自于 __________________。 答案 (1)能自我复制、具有标记基因、含一个至多个限制酶切割位点(答出两点即可) (2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入 了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基 上均能生长 四环素 (3)受体细胞 解析 (1)作为运载体必须具备如下特点：①能自我复制，从而在受体细胞中稳定保存；② 含标记基因，以供重组 DNA 的鉴定和选择；③具有一个至多个限制性核酸内切酶切割位点以 便外源 DNA 片段插入。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有 Ampr 的大肠杆菌才能够 生长。而 Ampr 位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无 Ampr， 故不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌 均具有 Ampr，因而能在培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的 Tetr，故含有插入 了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体 的大肠杆菌得以区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成 DNA，需借助宿主细 胞完成 DNA 复制。